癌癥基因突變及基因擴(kuò)增檢測的制作方法
【專利說明】癌癥基因突變及基因擴(kuò)增檢測 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及癌癥突變高發(fā)基因的檢測。本發(fā)明提供了基于多重PCR和高通量測序 技術(shù)的用于癌癥樣品的多基因、多位點(diǎn)突變檢測的引物組、試劑盒和檢測方法。所提供的檢 測結(jié)果例如可用于輔助診斷或指導(dǎo)臨床用藥方案。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是全球最主要的非傳染性疾病之一，也是目前致死率最高的慢性疾病，我國 每年因癌癥死亡的人數(shù)就高達(dá)270萬，其中W肺癌及胃癌、結(jié)直腸癌等消化道腫瘤最為嚴(yán) 重，而女性中W乳腺癌為首的婦科腫瘤也是癌癥死亡的主要原因。據(jù)統(tǒng)計，我國肺癌的發(fā)病 率為53. 57/10萬，死亡率高達(dá)45. 57/10萬，均處于所有惡性腫瘤之首，胃癌則W 36. 21/10 萬的發(fā)病率僅次之，而乳腺癌W 42. 55/10萬的發(fā)病率處于女性腫瘤之首。
[0003] 抗腫瘤祀向藥物是目前治療癌癥較為有效的一種手段，2013年全球銷量前十大 藥物近一半為抗腫瘤祀向藥物，抗腫瘤祀向藥物和其他化療藥物療效和毒副作用都因人 而異，該是因?yàn)楸举|(zhì)上講，癌癥是一種多基因突變造成的疾病。關(guān)鍵基因的突變、截斷、錯 位或融合等導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。由于無節(jié)制增長，腫瘤細(xì)胞發(fā)生了更多的基因突變，導(dǎo)致腫瘤 惡性化程度加深、轉(zhuǎn)移和抵抗治療，識別個體腫瘤特異性的驅(qū)動基因突變就成了有效的選 擇祀向藥物應(yīng)用的關(guān)鍵。目前NCCN(美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)）已對多種祀向藥物使用作 出規(guī)定，建議其在用于腫瘤治療前進(jìn)行基因突變檢測W確定是否適合用藥，例如吉非替尼 (gefitinib)、曲妥珠單抗等（Trastuzum油）。
[0004] 隨著科技發(fā)展，抗腫瘤藥物的發(fā)展也表現(xiàn)出藥物使用從單一到聯(lián)合的趨勢。W 前祀向藥物W單藥加化療為主，但大多數(shù)腫瘤是多基因疾病，針對單個祀點(diǎn)治療雖然能延 長生存，但很少能根治，故目前多個祀向藥物的聯(lián)合治療研究越來越多，最成功的例子就是 BRAF和MEK抑巧驚U聯(lián)合治療黑色素瘤。因此，同時能快捷地檢測多個藥物祀點(diǎn)基因檢測方 法就變得尤為重要，結(jié)合高通量測序的完全個體化的基因治療也被認(rèn)為是腫瘤治療最終努 力的方向。
[0005] 常見的癌癥相關(guān)基因包括下列基因：
[0006] BRAF基因編碼B-Raf蛋白。BRAF基因突變常見于黑色素瘤（50% )、非小細(xì)胞肺 癌（1-3%)，結(jié)直腸癌巧-15%)、腦膠質(zhì)瘤（4.0%)、卵巢癌（11%)及胃間質(zhì)瘤等高發(fā)腫 瘤中，其中W 15號外顯子的V600E突變尤為常見。
[0007] EGFR巧pidermal Growth Factor Rec巧tor)為表皮生長因子受體，屬于受體酪氨 酸激酶（RTKs)家族。EGFR中的突變在非小細(xì)胞肺癌患者中的發(fā)生頻率高達(dá)35%，主要發(fā) 生在18、19、20和21號外顯子上，而又^19號外顯子的9.6746_4750(16化11?64突變和21 號外顯子上的P.L858R突變最為常見。此外，EGFR中的突變還見于腦膠質(zhì)瘤（26% )和胃 腺癌（10%)中。EGFR中的突變可直接激活細(xì)胞下游的多種信號途徑，包括與細(xì)胞存活相 關(guān)的PI3K-AKT-mT0R途徑，W及與細(xì)胞增殖相關(guān)的RAS-RAF-MEK-E服途徑。
[000引 KRAS基因編碼K-Ras蛋白。KRAS基因突變多發(fā)于非小細(xì)胞肺癌（15-25% )、結(jié) 直腸癌（36 - 40%)、卵巢癌（14%)及甲狀腺癌等腫瘤中，主要發(fā)生在第2、3號外顯子上， KRAS突變可導(dǎo)致RAS GTP酶的組成性激活，該種激活狀態(tài)不受生長因子信號的調(diào)控，該一 結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞的持續(xù)增殖，并使EGFR TKI類藥物效果降低。
[0009] PIK3CA基因編碼pllOa蛋白，其為組成磯脂醜-3-激酶（PI3K)的催化亞基之一。 PI3K可參與激活下游的某些重要的信號蛋白，如AKT等。PIK3CA基因的突變主要發(fā)生在第9 和20號外顯子，常發(fā)生于非小細(xì)胞肺癌（1-3%)、乳腺癌（26%)、結(jié)直腸癌（10-30%)、 卵巢癌化.7% )等腫瘤中，有研究認(rèn)為PIK3CA的激活突變可能和癌細(xì)胞對EGFR TKI類藥 物產(chǎn)生抗性有關(guān)。
[0010] 肥R2(又稱化bB2)基因與EGFR-樣同屬于受體酪氨酸激酶家族，其基因突變常見 于非小細(xì)胞肺癌（2-4%)及乳腺癌（2%)中，而其擴(kuò)增突變常發(fā)生于多種腫瘤如乳腺癌 (18%)、胃癌（7~34%)、結(jié)直腸癌（3%)、食管癌（15%)及肺癌（22.8%)中。肥R2的 突變可激活細(xì)胞下游多種信號途徑，包括涉及細(xì)胞存活的PI3K-AKT-mT0R途徑和涉及細(xì)胞 增殖的RAS-RAF-MEK-E服途徑。
[OOU]目前已有不少針對上述基因的藥物，如針對EGFR基因?yàn)殪朦c(diǎn)的有吉非替 尼（gefitinib)、厄洛替尼巧rlotinib)，針對BRAF基因突變的藥物有維羅非尼 (Vemurafenib)、達(dá)拉非尼（ckbrafenib)，針對肥R2基因突變或擴(kuò)增的有拉帕替尼 (Lapatinib)、阿法替尼（Afatinib) W及曲妥珠單抗（Trastuzumab)等。
[0012] DNA堿基突變（包括點(diǎn)突變、插入突變和刪除突變等）和基因擴(kuò)增突變（即基因拷 貝數(shù)增加）是腫瘤細(xì)胞中最常見的兩種突變方式，也是在相關(guān)藥物研發(fā)中常用的祀標(biāo)。目 前常見的檢測多基因突變的方法主要有英光PCR法和一代Sanger測序法。英光PCR法具 有靈敏度高的特點(diǎn)，且技術(shù)已經(jīng)成熟，應(yīng)用廣泛，但是每對引物只能檢測一種突變，且每種 突變需要單獨(dú)建立一個PCR反應(yīng)體系，導(dǎo)致樣品用量較大，且無法同時檢測大量的樣品或 位點(diǎn)；一代Sanger測序法單對引物可檢測多個突變，具有成本低等特點(diǎn)，但每次擴(kuò)增只能 使用一對引物，無法同時檢測多個基因或多個樣品，而且所需樣品量大，且對低頻突變的檢 測不夠令人滿意。
[0013] 傳統(tǒng)的檢測基因擴(kuò)增的經(jīng)典方法為FISH(英光原位雜交技術(shù)），該技術(shù)有較好的 靈敏度，其最大的優(yōu)點(diǎn)是可直觀地在細(xì)胞核層面觀察基因擴(kuò)增情況，并且可通過英光的亮 度強(qiáng)弱來推測基因拷貝數(shù)的多少，但是該方法成本較高，對技術(shù)人員的操作也有較高要求， 且其結(jié)果判斷容易受多種因素影響，如多倍體細(xì)胞等等。
[0014] 多重PCR技術(shù)目前在多基因多位點(diǎn)的擴(kuò)增上有較好的應(yīng)化而相比普通PCR其也 具有高效、可對模版定量或定性等優(yōu)點(diǎn)，但其體系構(gòu)建需綜合目標(biāo)序列的同源性和長短、引 物動力學(xué)、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化等多種因素，例如目標(biāo)序列的長度范圍太大可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率 不均勻，引物濃度配比不當(dāng)或者引物間形成易形成二聚體均可影響總體擴(kuò)增效率或者擴(kuò)增 均勻性，目前市場上或者實(shí)驗(yàn)中同一體系一般較少超過同時存在五至六對引物的情況，由 此可見其在技術(shù)實(shí)現(xiàn)上具有相當(dāng)難度和要求。
[0015] 因此，仍然需要進(jìn)一步開發(fā)對DNA堿基突變和基因擴(kuò)增突變的檢測工具，W實(shí)現(xiàn) 對癌癥驅(qū)動基因的更有效、更準(zhǔn)確的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 除非另外說明，本申請中的各個術(shù)語的含義與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相 同。
[0017] 本發(fā)明基于多重PCR和高通量測序技術(shù)開發(fā)出用于同時檢測樣品中一個或多個 癌癥驅(qū)動基因的兩個或更多個外顯子的多個區(qū)域突變的引物組、試劑盒和檢測方法。所述 癌癥驅(qū)動基因特別是BRAF、EGFR、KRAS、PIK3CA和/或肥R2基因。所述突變可W是一個或 多個堿基的插入、取代和/或缺失，或基因擴(kuò)增突變。
[0018] 本發(fā)明的檢測引物可用于擴(kuò)增8^。、66。3、1(^5、？11(3〔4和/或肥1?2基因的外顯 子上的相應(yīng)區(qū)域，然后將擴(kuò)增的目標(biāo)片段進(jìn)行高通量測序，獲得目標(biāo)片段的序列信息，并由 此獲得突變檢測結(jié)果。
[0019] 因此，本發(fā)明的目的是提供用于同時檢測樣品中一個或多個癌癥驅(qū)動基因的兩個 或更多個外顯子的多個區(qū)域突變的引物組；包含該引物組的試劑盒；使用所述引物組和/ 或試劑盒擴(kuò)增所述癌癥驅(qū)動基因或檢測所述癌癥驅(qū)動基因的外顯子突變的方法。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供用于檢測樣品中一個或多個癌癥驅(qū)動基因的一個或 多個外顯子的突變的引物組，包含用于在一個多重PCR中同時擴(kuò)增選自BRAF、EGFR、KRAS、 PIK3CA和/或肥R2基因的一個或多個基因的一個或多個外顯子的多個區(qū)域的檢測引物對， 其包含選自表1引物對中的至少3對引物：
[0021] 表1檢測引物對
[0022]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于檢測樣品中一個或多個癌癥驅(qū)動基因的一個或多個外顯子的突變的引物組，包 含用于在一個多重？〇?中同時擴(kuò)增選自8狀?36?1?、1(狀5、？11(304和/或冊1?2基因的一個 或多個基因的一個或多個外顯子的多個區(qū)域的檢測引物對，其包含選自下列引物對中的至 少3對、至少4對、至少5對、至少6對、至少7對、至少8對、至少9對、至少10對、至少11 對、至少12對、至少13對、至少14對、或全部15對引物： 用于擴(kuò)增BRAF基因的外顯子11的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID ΝΟ:1和2所示； 用于擴(kuò)增BRAF基因的外顯子15的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID NO:3和4所示； 用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子18的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID NO:5和6所示； 用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子19的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID NO:7和8所示； 用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子20的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID NO:9和10所示； 用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子20的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID NO: 11和12所示； 用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子21的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID NO: 13和14所示； 用于擴(kuò)增KRAS基因的外顯子3的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID NO: 15和16所示； 用于擴(kuò)增KRAS基因的外顯子2的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID NO: 17和18所示； 用于擴(kuò)增PIK3CA基因的外顯子9的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID NO: 19和20所 示； 用于擴(kuò)增PIK3CA基因的外顯子20的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID N0:21和22所 示； 用于擴(kuò)增HER2基因的外顯子19的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID N0:23和24所示； 用于擴(kuò)增HER2基因的外顯子20的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID N0:25和26所示； 用于擴(kuò)增HER2基因的外顯子21的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID N0:27和28所示； 和/或 用于擴(kuò)增HER2基因的外顯子21的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID N0:29和30所示。
2. 權(quán)利要求1的引物組，其中所述多重PCR的反應(yīng)條件為99°C預(yù)熱2min，每個循環(huán) 99°C變性15s，60°C退火4min，共23個循環(huán)，最后儲存于KTC備用。
3. 權(quán)利要求1或2的引物組，其進(jìn)一步包含用