用于純化轉(zhuǎn)基因因子vii的方法
【專利說明】用于純化轉(zhuǎn)基因因子VI I的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及尤其是用于純化轉(zhuǎn)基因來源的重組人活化因子VII的抗因子VII親和 配體。組合其他正交色譜步驟的親和配體允許制備高度純化的FVII溶液，其被完全活化、 不含聚集體并具有低百分比的降解或氧化的FVII形式。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 因子VII (FVII)是一種維生素K依賴性糖蛋白，其活化形式（FVIIa)參與凝結(jié)過 程，在鈣和組織因子存在下活化因子X和因子IX。FVII是以406個(gè)殘基的單肽鏈形式分 泌，具有約50kDa的分子量。FVII包含四個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域：N端Y羧基結(jié)構(gòu)域（Gla)、 兩個(gè)"表皮生長因子（EGF)-樣結(jié)構(gòu)域"以及絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。FVII向FVIIa的活化表 征為Argl52-Ilel53結(jié)構(gòu)域（精氨酸152-異亮氨酸153)連接的裂解。因此，F(xiàn)VIIa是這 樣的化合物：具有分子量約20kDa的152個(gè)氨基酸的輕鏈，并且具有分子量約30kDa的254 個(gè)氨基酸的重鏈，通過單一的二硫鍵（Cysl35-Cys262)彼此相連。
[0004] 血漿的FVIIa包含幾個(gè)翻譯后修飾：前十個(gè)谷氨酸被Y -羧酸化，Asp63被部分 羥基化，Ser52 (絲氨酸52)和Ser60 (絲氨酸60)被0-糖基化并且分別攜帶葡萄糖（木 糖）0-2和巖藻糖型，Asnl45 (天冬酰胺145)和Asn322 (天冬酰胺322)主要通過二觸角 (biantennary)二唾液酸化（bisialylated)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)被N-糖基化。
[0005] FVII用于治療表現(xiàn)為因子VIII (A型血友?。┗蛞蜃覫X (B型血友病）缺陷的血友 病患者，以及表現(xiàn)出凝固因子的其他缺陷的患者，例如，F(xiàn)VII的先天性缺陷。因此有必要獲 得注射用FVIIa濃縮物。
[0006] 獲取FVIIa濃縮物的最古老的方法是從通過血漿分級(jí)得到的血漿蛋白質(zhì)中純化 FVIIa。為這一目的，EP 0 346 241描述了富含F(xiàn)VIIa的級(jí)分的制備，其在吸附、接著洗脫包 含F(xiàn)VII和FVIIa以及其他蛋白質(zhì)如因子IX(FIX)、X(FX)和II (FII)的血漿蛋白質(zhì)的分級(jí) 二級(jí)產(chǎn)物，特別是PPSB的預(yù)洗脫液（P =凝血酶原或FII，P =前轉(zhuǎn)變素或FVII，S =斯圖亞 特因子或FX，以及B =抗血友病因子B或FIX)后獲得。這種方法的缺點(diǎn)在于獲取的FVII 仍然含有一些痕量的其他凝固因子。
[0007] 同樣地，文獻(xiàn)EP 0 547 932描述了基本上不含維生素K依賴因子和FVIII的高純 度FVIIa濃縮物的制備工藝。通過這一工藝獲得的FVII，不管其純度，但仍表現(xiàn)出殘留的血 栓形成活性。
[0008] -般而言，這些方法的主要缺點(diǎn)之一是它們只能產(chǎn)生小量的產(chǎn)物。此外，還難以獲 取完全不含在血漿中存在的其它蛋白質(zhì)的產(chǎn)物。最后，盡管在制備血漿凝固因子的每個(gè)階 段都實(shí)施了一些預(yù)防措施來確保它們的病毒和細(xì)菌安全性（隨訪獻(xiàn)血者、檢測(cè)已知病毒和 細(xì)菌污染的測(cè)試、嚴(yán)格的純化和病毒失活處理以盡可能減少傳輸血液傳播致病物的危險(xiǎn)）， 然而，并不完全排除致病物污染的風(fēng)險(xiǎn)。此外，克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病的新變種的出現(xiàn) 造成了通過血液產(chǎn)品非常規(guī)致病物傳播的恐懼。此外，從獻(xiàn)血者采集的血漿體積仍然有限。
[0009] 因此，自從二十世紀(jì)八十年代，編碼人因子VII的DNA被分離出來（Hagen等人； Proc. Natl. Acad. Sci.，1986, 83 (8) : 2412-6)，并在各種表達(dá)體系中表達(dá)。
[0010] 已進(jìn)一步描述了多種用于重組因子VII的純化的工藝（參見例如 W02009/141418)。目前的重組因子VII多肽通常是由一個(gè)或兩個(gè)不同的多步工藝純化，或 者只采用在常規(guī)樹脂上的色譜，或者包括使用具有蛋白質(zhì)配體的親合樹脂的親和色譜。
[0011] 重組因子VII可以通過分批發(fā)酵或由轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物產(chǎn)生。特別地，描述了在雌 兔的乳腺中產(chǎn)生的FVII組合物，例如在專利申請(qǐng)W02007/138199中。通過轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物 在乳中產(chǎn)生的FVII然后可從乳中純化，例如通過切向過濾和色譜，或通過鈣沉淀，隨后數(shù) 個(gè)色譜步驟。
[0012] 然而，可用的純化方法并非沒有缺點(diǎn)。尤其是可能仍然存在來自轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物 的天然蛋白質(zhì)，特別是來自轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的天然因子VII，這會(huì)在向人類患者給藥時(shí)觸發(fā) 免疫原性。
[0013] 發(fā)明概述
[0014] 本發(fā)明的一個(gè)目的是一種從源生物材料純化轉(zhuǎn)基因因子VII (TgFVII)和/或轉(zhuǎn)基 因活化因子VII (TgFVIIa)的方法，包括親和色譜的步驟，該親和色譜包括步驟：
[0015] (a)在允許TgFVII和/或TgFVIIa結(jié)合配體的條件下，使含有TgFVII和/或 TgFVIIa的源生物材料接觸對(duì)TgFVII和/或TgFVIIa特異的配體，和
[0016] (b)通過以非破壞性的方式打斷與所述配體的相互作用，回收TgFVII和/或 TgFVIIa。
[0017] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，配體是針對(duì)至少一種TgFVII和/或TgFVIIa表位，或其 功能片段或衍生物的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，配體包括形成兩個(gè)完整的抗原結(jié)合位點(diǎn)的 兩條重多肽鏈且缺乏輕多肽鏈，并且是源自駱駝科的免疫球蛋白重鏈。
[0018] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法是這樣的，即步驟（b)包括至少一個(gè)洗滌步驟，用 于在從配體洗脫TgFVII或TgFVIIa之前除去未結(jié)合的材料，并且進(jìn)一步任選地包括用于除 去結(jié)合在樹脂上且具有比TgFVII或TgFVIIa更弱親和力的污染物的第二洗滌步驟。
[0019] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用于純化TgFVII或TgFVIIa的源生物材料獲自生產(chǎn) TgFVII和/或TgFVIIa的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。優(yōu)選地，所述動(dòng)物是雌性哺乳動(dòng)物，并優(yōu)選雌兔，以 及源生物材料是乳。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括在步驟（a)之前的收集并澄清乳的預(yù)備 步驟。優(yōu)選地，通過加入檸檬酸鹽，然后過濾來執(zhí)行乳澄清步驟。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括在其中TgFVII和/或TgFVIIa被保留在 離子交換劑上的條件下，在離子交換劑上，并優(yōu)選在陰離子交換劑上，對(duì)洗脫的TgFVII和/ 或TgFVIIa的色譜純化的步驟c)。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括在其中TgFVII和/或TgFVIIa被保留 在偽親和樹脂上的條件下，在偽親和樹脂，并優(yōu)選在羥磷灰石上，對(duì)洗脫的TgFVII和/或 TgFVIIa的色譜分離的步驟d)。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括在尺寸排阻支持物上對(duì)洗脫的TgFVII 和/或TgFVIIa的色譜分離的步驟e)。這一步驟優(yōu)選地致力于TgFVII和/或TgFVIIa拋 光和配制。
[0024] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括消除和/或滅活病毒的至少一個(gè)步驟， 優(yōu)選通過納米過濾和/或通過溶劑/去污劑處理。
[0025] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括配制、殺菌和冷凍干燥經(jīng)純化的TgFVII 和/或TgFVIIa的最終步驟。
[0026] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在親和色譜步驟期間，本發(fā)明的方法還包括步驟：
[0027] (a)在使所述配體結(jié)合TgFVII和/或TgFVIIa的條件下，用來自含有重組產(chǎn)生的 TgFVII和/或TgFVIIa的轉(zhuǎn)基因雌兔的乳裝載已經(jīng)固定有如上所定義的配體的色譜樹脂；
[0028] (bl)洗滌未結(jié)合的材料；
[0029] (b2)洗滌具有對(duì)配體的親和力比TgFVII和/或TgFVIIa更弱的污染物；和
[0030] (B3)從樹脂洗脫 TgFVII 和 / 或 FVIIa。
[0031] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明方法的親和色譜步驟期間，所述用于除去弱結(jié)合的 材料的第二洗滌步驟是由包含10%至50%的疏水劑的緩沖液執(zhí)行，并且其離子強(qiáng)度是從 200至600mM的范圍。
[0032] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明方法的親和色譜步驟期間，所述用于從樹脂洗脫 TgFVII和/或TgFVIIa的洗脫步驟是由包含20%到70%的疏水劑的緩沖液執(zhí)行，并且其離 子強(qiáng)度是從500至2500mM的范圍。
[0033] 參考以下列出的附圖，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將從作為非限制性實(shí)例給出的本 發(fā)明實(shí)施方案的以下描述中顯而易見。
[0034] 附圖的簡要說明
[0035] 圖1展示具有重多肽鏈而缺少輕鏈的駱駝科免疫球蛋白的IgGl、IgG2和IgG3形 式的圖示。
[0036] 圖2展示在本發(fā)明工藝期間的RMP清除的圖示。RMP水平以ppm指示作為該工藝 的步驟的函數(shù)。
[0037] 圖3展示在本發(fā)明工藝期間的DNA清除的圖示。DNA水平以ppb指示作為該工藝 的步驟的函數(shù)。
[0038] 圖4展示通過純化工藝的TgFVII活化。泳道1-9分別對(duì)應(yīng)于：泳道1和9 :分子 量，泳道2 :澄清乳，泳道3 :FVII-選擇的洗脫液（在本發(fā)明的配體親和色譜之后），泳道4 : 中間產(chǎn)物1 (在超濾后和滲濾后），泳道5 :納米過濾，泳道6 :QSXL洗脫液，泳道7 :CHT-I洗 脫液，泳道8 : SEC池。
[0039] 圖5展示了在預(yù)過濾和溶劑/去污劑處理（樣品命名為初始加載）的步驟后，以 及在親和FVII選擇色譜（樣品命名為洗脫液A)洗脫后，在樣品中的病毒負(fù)載的直方圖。
[0040] 發(fā)明詳細(xì)說明
[0041] 轉(zhuǎn)基因因子VII或因子Vila
[0042] 本發(fā)明純化方法特別地是依賴于使用對(duì)轉(zhuǎn)基因因子VII (TgFVII)和/或轉(zhuǎn)基因活 化因子VII (TgFVIIa)表現(xiàn)出特異性親和力的配體。
[0043] 用于本發(fā)明中的轉(zhuǎn)基因因子VII和因子Vila的氨基酸序列是已知的。特別地，轉(zhuǎn) 基因因子VII的氨基酸序列與人因子VII的氨基酸序列（如在美國專利號(hào)4, 784, 950中公 開）相同。
[0044] 源生物材料
[0045]本發(fā)明的方法尤其用于純化從各種生物來源獲得的轉(zhuǎn)基因FVII和/或FVIIa，它 們?cè)诖吮环Q為"源生物材料"。
[0046] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，源生物材料含有轉(zhuǎn)基因FVII和/或FVIIa并且獲自 已被修飾來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因FVII和/或FVIIa的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（或者是已被修飾的動(dòng)物的后代） 的體液的分級(jí)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物優(yōu)選哺乳動(dòng)物，例如牛、兔、山羊、綿羊等。優(yōu)選地，含有TgFVII 和/或TgFVIIa的源生物材料是哺乳動(dòng)物乳的樣品，即在其乳中生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因FVII和/或 FVIIa的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物乳的樣品。
[0047] 用于在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳中生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因FVII蛋白質(zhì)的方法可以包括以下步驟：將 包含編碼轉(zhuǎn)基因FVII (其氨基酸序列對(duì)應(yīng)于人FVII)的基因的合成的DNA分子轉(zhuǎn)移到非人 哺乳動(dòng)物胚胎中，該基因是由乳中天然分泌的蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子控制的。隨后將胚胎引入相 同物種的雌性哺乳動(dòng)物中，該雌性哺乳動(dòng)物然后生出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。一旦對(duì)象充分發(fā)育，誘導(dǎo) 哺乳動(dòng)物泌乳并收集乳。乳將含有所需的重組蛋白。EP 0 527 063提供了在除了人類以 外的其他雌性哺乳動(dòng)物的乳中制備轉(zhuǎn)基因FVII (TgFVII)的工藝的一個(gè)實(shí)例。在這個(gè)具體 實(shí)施方案中，通過引入含有用于WAP基因的啟動(dòng)子的序列構(gòu)建了含有WAP啟動(dòng)子的質(zhì)粒，并 且這