肉蓯蓉苷a標(biāo)準(zhǔn)品的半制備液相色譜方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，具體涉及肉蓯蓉苷A標(biāo)準(zhǔn)品的半制備液相色譜方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肉灰蓉屬（CistancheHoffmg.etLink)為列當(dāng)科（Orobanchaceae)多年生草 本寄生植物，主要分布在溫暖的沙漠、荒漠地帶，我國(guó)主要分布于西北各省區(qū)，新疆是其中 主要產(chǎn)區(qū)。該種植物在我國(guó)有4種1變種，分別為荒漠肉灰蓉（Cistanchedeserticola Y.C.Ma)、管花肉灰蓉（Cistanchetubulosa(Schenk)Wight)、鹽生肉灰蓉（Cistanche salsa(C.A.Mey.)G.Beck)、沙灰蓉（CistanchesinensisG.Beck)、及白花鹽灰蓉 (C.salsa(C.A.Mey. )G.BeckVar.albioforaP.F.TuetZ.C.Lou)。鹽生肉灰蓉（Cistanche salsa(C.A.Mey. )G.Beck)又名肉灰蓉、鹽生大蕓，其中含有大量的苯乙醇苷類及環(huán)稀醚貓 類、揮發(fā)性成分、木脂素類、多糖、生物堿等。主要藥理作用：增強(qiáng)免疫功能、補(bǔ)腎壯陽(yáng)、抗氧 化抗衰老、抗輻射、通便等。其中苯乙醇苷類具有壯陽(yáng)、有抗炎抗菌、抗腫瘤、保肝、抗氧化、 抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、強(qiáng)心增強(qiáng)記憶等多種功能，是肉蓯蓉中的主要活性成分。
[0003] 肉蓯蓉苷A是鹽生肉蓯蓉中含量較高的苯乙醇苷類，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)報(bào)道， 可根據(jù)肉蓯蓉苷A的含量多少作為鑒別鹽生肉蓯蓉、管花肉蓯蓉、荒漠肉蓯蓉的依據(jù)。因此 進(jìn)一步研宄肉蓯蓉苷A單體的活性和體內(nèi)藥物學(xué)過(guò)程具有重要的意義。肉蓯蓉苷A的對(duì) 照品在現(xiàn)今的市面上幾乎沒(méi)有，因此，有必要對(duì)其迸行分離和純化，以滿足實(shí)驗(yàn)和市場(chǎng)的需 要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種肉蓯蓉苷A標(biāo)準(zhǔn)品的 半制備液相色譜方法，利用半制備高效液相色譜結(jié)合大孔吸附樹(shù)脂和薄層層析色譜技術(shù)從 鹽生肉蓯蓉的乙醇提取物中分離純化得到純度達(dá)到95%以上的肉蓯蓉苷A。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：肉蓯蓉苷A標(biāo)準(zhǔn)品的半制備液相 色譜方法，包括以下步驟：
[0006] 1)將鹽生肉蓯蓉的干燥肉質(zhì)莖5kg粉碎成粗粉后，用70%乙醇加熱回流提取3 次，每次2h，合并提取液，濃縮得浸膏，加少量水混懸，得到混懸液；
[0007] 2)將步驟1)得到的混懸液，依次用乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，直至上層澄清 為止，萃取液濃縮成浸膏，得到肉蓯蓉萃取浸膏；
[0008] 3)取水飽和正丁醇萃取物900g，用水溶解，注入柱體積5. 5L的D-101大孔吸附樹(shù) 脂柱中，以6倍柱體積去離子水洗脫，回收洗脫液，濃縮備用；分別以10倍柱體積的10%、 20 %、30 %乙醇-水溶液洗脫，回收洗脫液，濃縮備用；再用40 %的乙醇-水洗脫，以1000mL 為一個(gè)餾分，用GF254薄層板檢識(shí)，以5%的香草醛-濃硫酸作為顯色劑；
[0009] 4)收集并合并有目標(biāo)的餾分減壓濃縮成浸膏，濃縮物30g經(jīng)薄層層析硅膠H柱用 最佳流動(dòng)相：氯仿：正丁醇：甲醇：水為4:2:2:0. 5洗脫，是采用干法上柱，干法上樣，空白 硅膠1. 5kg，伴樣硅膠：樣品=2:1，直至有流動(dòng)相流出，按照硅膠洗脫后顏色變化情況將柱 子切成10段，每段用甲醇沖洗至濃縮不出浸膏即可，并用GF254薄層板檢識(shí)，將含有較高純 度的8段浸膏10g中取lg上ODS柱，其中樣品：ODS為1:10,柱內(nèi)徑為1.8cm，依次用5%、 10 %、20 %至100 %的甲醇-水溶液洗脫10個(gè)柱體積，減壓濃縮至干，減壓濃縮的水浴鍋溫 度小于60°C，并用GF254薄層板檢識(shí)，將含量較高的5%、10%甲醇-水洗脫部分分別上半 制備液相；
[0010] 5)將0DS5%甲醇-水洗脫部分浸膏用甲醇溶解配置成10mg/mL的濃度，采用半 制備型高效液相色譜法純化，進(jìn)樣量為100y1，收集保留時(shí)間為47. 8min的組分，再將其在 小于60°C下減壓濃縮，得到淡黃色無(wú)定形粉末；或?qū)?DS10%甲醇-水洗脫部分浸膏用甲 醇溶解配置成18. 3mg/mL的濃度，采用半制備型高效液相色譜法純化，進(jìn)樣量為100y1，收 集保留時(shí)間為45. 8min的組分，再將在小于60°C下減壓濃縮，得到淡黃色無(wú)定形粉末。
[0011] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的肉蓯蓉苷A標(biāo)準(zhǔn)品的半制備液相色譜方法， 得到的淡黃色無(wú)定形粉末，經(jīng)過(guò)熔點(diǎn)、熔程的測(cè)定、薄層色譜法檢測(cè)純度、顯色反應(yīng)、核磁結(jié) 構(gòu)鑒定及高效液相色譜法檢測(cè)純度，證明了上述淡黃色無(wú)定形粉末是純度大于95%的肉蓯 蓉苷A單體，此方法操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，可用于肉蓯蓉苷A及其他苯乙醇苷類化合物的大 量制備。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1為0DS5 %甲醇-水洗脫部分半制備高效液相色譜圖。
[0013] 圖2為0DS10%甲醇-水洗脫部分半制備高效液相色譜圖。
[0014] 圖3為不同點(diǎn)樣量的淡黃色無(wú)定形粉末氯仿-乙酸乙酯-丙酮-甲醇-甲酸= 1:8:1:2:3 展開(kāi)圖。
[0015] 圖4為不同點(diǎn)樣量的淡黃色無(wú)定形粉末氯仿-正丁酮-甲醇-無(wú)水甲酸=6:1:2:2 展開(kāi)圖。
[0016] 圖5為不同點(diǎn)樣量的淡黃色無(wú)定形粉末氯仿-正丁酮-甲醇-無(wú)水乙酸=6:1:2:2 展開(kāi)圖。
[0017] 圖6為苷A純度檢測(cè)高效液相色譜圖（254nm)。
[0018] 圖7為苷A純度檢測(cè)高效液相色譜圖（332nm)。
[0019] 圖8為肉蓯蓉苷A的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 一、儀器及試劑來(lái)源：
[0021] 1、所用儀器及來(lái)源：
[0022] 高效液相色譜儀（WatersE2695)，檢測(cè)器（Waters2998PDA檢測(cè)器）；液相工作 站（Empower3,Waters);半制備液相色譜儀（日本島津LC-600)，檢測(cè)器（島津SPD-10A)， 半制備液相工作站（浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司N2000);超導(dǎo)核磁波譜共振儀（IN0VA 600M，，美國(guó)VARIAN公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N-1001V型，日本EYELA) ;D-101大孔吸附樹(shù)脂 (滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；硅膠H薄層層析硅膠（青島海洋化工有限公司制 造）；硅膠GF254(20Xl〇cm，青島海洋化工分廠，批號(hào)20130312);超低有機(jī)物超純水機(jī) (Milli_Q，Millipore);依利特HypersilBDSC18(4.6mmX250mm，5iim);半制備色譜柱 COSMOSILPackedColumn5C18-MS-II(201.D.X250mm，5ym);SGWX-4 顯微熔點(diǎn)儀（上 海精密科學(xué)儀器有限公司）；半自動(dòng)點(diǎn)樣儀（CAMAGLINOMAT5);薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng) (CAMAGREPROSTAR3) ;100y1 微量進(jìn)樣針。
[0023] 2、所用試劑及來(lái)源：
[0024] 三氯甲燒、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、甲醇、無(wú)水甲酸、無(wú)水乙酸、95%乙醇、水（雙 蒸），濃硫酸、無(wú)水乙醇（均為分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；香草醛（天津市天 隆精細(xì)化工分公司）；色譜乙腈、色譜甲醇（均為色譜純，sigma)。實(shí)驗(yàn)所用鹽生肉蓯蓉藥 材均為新疆吉木薩爾縣和奇臺(tái)縣。
[0025] 二、色譜條件：
[0026] 半制備型HPLC:C0SM0SILPackedColumn5C18-MS-II(20I.D.X250mm，5ym);流 動(dòng)相：乙腈-水（體積比：17:83);流速5mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為332 ;進(jìn)樣體積100y1 ;柱溫 為室溫。
[0027] 高效液相型HPLC:色譜條件：依利特BDS柱（4. 6mmX250mm，5um);流動(dòng)相：乙腈 (△)-0.45%磷酸-水出），梯度洗脫如表1所示，流速0.75111171^11;柱溫351：;檢測(cè)波長(zhǎng) 332nm和 254nm;進(jìn)樣體積 10y1。
[0028] 表 1
[0029]
[0030] 實(shí)施例丄：
【主權(quán)項(xiàng)】
1.肉蓯蓉苷A標(biāo)準(zhǔn)品的半制備液相色譜方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 將鹽生肉蓯蓉的干燥肉質(zhì)莖5kg粉碎成粗粉后，用70%乙醇加熱回流提取3次，每次 2h，合并提取液，濃縮得浸膏，加少量水混懸，得到混懸液； 2) 將步驟1)得到的混懸液，依次用乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，直至上層澄清為止， 萃取液濃縮成浸膏，得到肉蓯蓉萃取浸膏； 3) 取水飽和正丁醇萃取物900g，用水溶解，注入柱體積5. 5L的D-101大孔吸附樹(shù)脂 柱中，以6倍柱體積去離子水洗脫，回收洗脫液，濃縮備用；分別以10倍柱體積的10%、20%、 30%乙醇-水溶液洗脫，回收洗脫液，濃縮備用；再用40%的乙醇-水洗脫，以1000 mL為一 個(gè)餾分，用GF254薄層板檢識(shí)，以5%的香草醛-濃硫酸作為顯色劑； 4) 收集并合并有目標(biāo)的餾分減壓濃縮成浸膏，濃縮物30g經(jīng)薄層層析硅膠H柱用最佳 流動(dòng)相：氯仿：正丁醇：甲醇：水為4:2:2:0. 5洗脫，是采用干法上柱，干法上樣，空白硅膠 I. 5kg，伴樣硅膠：樣品=2:1，直至有流動(dòng)相流出，按照硅膠洗脫后顏色變化情況將柱子切 成10段，每段用甲醇沖洗至濃縮不出浸膏即可，并用GF254薄層板檢識(shí)，將含有較高純度 的8段浸膏IOg中取Ig上ODS柱，其中樣品：ODS為1:10,柱內(nèi)徑為I. 8cm，依次用5%、10%、 20%至100%的甲醇-水溶液洗脫10個(gè)柱體積，減壓濃縮至干，減壓濃縮的水浴鍋溫度小于 60°C，并用GF254薄層板檢識(shí)，將含量較高的5%、10%甲醇-水洗脫部分分別上半制備液相； 5) 將ODS 5%甲醇-水洗脫部分浸膏用甲醇溶解配置成10mg/mL的濃度，采用半制備 型高效液相色譜法純化，進(jìn)樣量為100 μ 1，收集保留時(shí)間為47. Smin的組分，再將其在小于 60°C下減壓濃縮，得到淡黃色無(wú)定形粉末；或 將ODS 10%甲醇-水洗脫部分浸膏用甲醇溶解配置成18. 3mg/mL的濃度，采用半制備 型高效液相色譜法純化，進(jìn)樣量為100 μ 1，收集保留時(shí)間為45. Smin的組分，再將在小于 60°C下減壓濃縮，得到淡黃色無(wú)定形粉末。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種肉蓯蓉苷A標(biāo)準(zhǔn)品的半制備液相色譜方法，是利用半制備高效液相色譜結(jié)合大孔吸附樹(shù)脂和薄層層析色譜技術(shù)從鹽生肉蓯蓉的乙醇提取物中分離純化得到純度達(dá)到95%以上的肉蓯蓉苷A。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的肉蓯蓉苷A標(biāo)準(zhǔn)品的半制備液相色譜方法，得到的淡黃色無(wú)定形粉末，經(jīng)過(guò)熔點(diǎn)、熔程的測(cè)定、薄層色譜法檢測(cè)純度、顯色反應(yīng)、核磁結(jié)構(gòu)鑒定及高效液相色譜法檢測(cè)純度，證明了上述淡黃色無(wú)定形粉末是純度大于95%的肉蓯蓉苷A單體，此方法操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，可用于肉蓯蓉苷A及其他苯乙醇苷類化合物的大量制備。
【IPC分類】C07H1-08, C07H15-18
【公開(kāi)號(hào)】CN104650161
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410842745
【發(fā)明人】熱娜·卡斯木, 曹苑, 王曉梅, 楊建華, 胡君萍, 王新玲, 王小青, 李敏
【申請(qǐng)人】新疆醫(yī)科大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2014年12月30日