一種魚類前胸腺素α及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種魚類（半滑舌鰨）前胸腺素a及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 前胸腺素a(ProTthymosinalpha,ProTTa)是一種強(qiáng)酸性蛋白，分子量約為 12. 5kDa。該蛋白的氨基酸組成中缺乏芳香族和含硫類氨基酸且沒有固定的天然構(gòu)象。前 胸腺素a可以被溶酶體天冬酰胺內(nèi)肽酶水解，從而產(chǎn)生一個(gè)含有28個(gè)氨基酸的活性多 肽-胸腺素a 1。前胸腺素a主要作用于細(xì)胞的增殖和分化。越來(lái)越多的研宄表明，在哺 乳動(dòng)物中，前胸腺素a擁有免疫調(diào)節(jié)以及細(xì)胞因子樣的功能，例如可以刺激IL-2受體的上 調(diào)表達(dá)、促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟、促趨化和抗感染活性等。哺乳動(dòng)物前胸腺素a作為Tol 1 樣受體TLR4的內(nèi)生性配體可以刺激免疫調(diào)節(jié)因子I型干擾素的釋放，進(jìn)而有效激活殺傷性 T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞。然而，魚類前胸腺素a的功能和應(yīng)用潛能尚不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的在于提供一種魚類（半滑舌鰨）前胸腺素a及其應(yīng)用。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0005] 一種魚類前胸腺素a重組蛋白，魚類前胸腺素a重組蛋白為半滑舌鰨的前胸腺 素a重組蛋白，其是以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物F1和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增前胸腺素a基 因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化即為重組蛋白，所述F1為5 ' -GATATCATGGCGGACAGCAAAG-3 ' ； R1 為 5' -GATATCCTGGTCTGTCTTCTGCT-3'。
[0006] 一種魚類前胸腺素a重組蛋白的應(yīng)用，所述半滑舌鰨的前胸腺素a重組蛋白可 應(yīng)用于制備抑制抗病毒的制劑。
[0007] 所述病毒為細(xì)胞腫大病毒。
[0008] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的前胸腺素a注射魚類后能夠顯著提高魚類的抗 病毒能力。
【附圖說(shuō)明】
[0009] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的前胸腺素a蛋白電泳圖。泳道1，分子量標(biāo)準(zhǔn)； 泳道2，前胸腺素a。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而 非以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
[0011] 在本發(fā)明實(shí)施例中所涉及到的常規(guī)性實(shí)驗(yàn)方法均采用如下方法：
[0012] 1.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用"天根生化科技 (北京）有限公司"的相應(yīng)試劑盒。
[0013] 2?大腸桿菌用Hanahan方法（SambrookandRussell:MolecularCloning: A LaboratoryMannual.ColdSpringHarborLaboratoryPress2001)〇
[0014] 3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購(gòu)自于"紐英倫生物技術(shù)有限公司"，北京。
[0015] 實(shí)施例1
[0016] 前胸腺素a重組蛋白的制備
[0017] 1)表達(dá)前胸腺素a重組蛋白的質(zhì)粒pPr〇T的構(gòu)建：
[0018] 本發(fā)明的前胸腺素a序列已公布（GenBankaccessionnumber XM_008334972. 1)。前胸腺素a由103個(gè)氨基酸組成，沒有固定的結(jié)構(gòu)域，唯一保守的特征 是強(qiáng)酸性（等電點(diǎn)3. 6)。以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物F1和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增前胸腺 素a基因。PCR條件為：94°C60s預(yù)變性模板DNA，然后 94°C40s，53°C60s，72°C60s，30 個(gè)循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)7 - 10min。PCR產(chǎn)物用天根的相應(yīng)試劑盒純化。將表達(dá)載體 pET259(構(gòu)建過程參見HuYH,Zhengffff,SunL.Identificationandmolecularanalysis ofaferritinsubunitfromreddrum(Sciaenopsocellatus).FishShellfishImmunol 2010 ;28:678 - 86)用限制性內(nèi)切酶EcoRV酶切后回收5. 3kb片段，將其與上述純化的PCR 產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a，在含卡那霉素（l〇〇ug/ml)的LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，命名為pProT。通過DNA測(cè)序分析證明 了pProT為含有強(qiáng)酸性（等電點(diǎn)3. 6)特征的胸腺素a序列的表達(dá)質(zhì)粒，其中，pPr〇T質(zhì)粒 中前胸腺素a序列與GenBankaccession公開的numberXM_008334972. 1序列一致。
[0019] 所述LB組成成分按重量百分比計(jì)：1. 0 %蛋白胨，0. 5 %酵母粉，1. 0 % 氯化鈉，97. 5 % 蒸餾水。所述 F1 為 5' -GATATCATGGCGGACAGCAAAG-3' ；R1 為 5' -GATATCCTGGTCTGTCTTCTGCT-3'。
[0020] 2)前胸腺素a重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化
[0021 ] 將上述的質(zhì)粒pProT用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)(購(gòu)自于"天根生化科技 有限公司"，北京），在含有卡那霉素（50ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時(shí)，挑 取轉(zhuǎn)化子，將其命名為BL21/pProT。
[0022] 將BL21/pPr〇T于含有卡那霉素（50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取1ml 過夜后的培養(yǎng)液，加入l〇〇ml新鮮的含有卡那霉素（50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C 下轉(zhuǎn)速200rpm搖動(dòng)培養(yǎng)至0D 6QQ為0. 6,加入終濃度為ImM的IPTG，28°C繼續(xù)以轉(zhuǎn)速160rpm 搖動(dòng)培養(yǎng)5h，而后以5000g，4°C離心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室溫于搖床上緩 慢搖動(dòng)1-2小時(shí)，直至菌懸液變澄清為止。將菌液以10000g，4°C離心30min，回收上清。將 上清中的蛋白用親和層析柱His Trap HP Columns (購(gòu)于美國(guó)GE Healthcare公司）回收 純化。將純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)（8v/cm電壓下電泳25 - 30min，隨后15v/cm電 壓下電泳2 - 2. 5h)，測(cè)定其分子量大?。▍⒁妶D1)。發(fā)現(xiàn)它的蛋白質(zhì)質(zhì)量與前胸腺素a 相同。
[0023] 所述裂解液為終濃度的10mM NaH2P04、10mM Tris和8M尿素，pH8. 0。
[0024] 實(shí)施例2
[0025] 前胸腺素a的應(yīng)用
[0026] 步驟1)前胸腺素a的注射
[0027] 將上述實(shí)施例1純化的前胸腺素a蛋白在PBS中稀釋至200ug/ml，即為前胸腺 素a稀釋液。將20條半滑舌鰨（重約13. 4g)隨機(jī)分為2組，每組10條。將這2組分別 命名為A和B。將A組的每條魚分別注射100ul前胸腺素a稀釋液，將B組（對(duì)照組）的 每條魚分別注射l〇〇ulPBS。
[0028] 所述PBS組成成分按重量百分比計(jì)：0. 8 %NaCl, 0. 02 %KC1, 0. 358 % Na2HP04. 12H20, 0? 024%NaH2P04,余量為水。
[0029] 步驟2)病毒懸液制備
[0030] 將細(xì)胞腫大病毒RBIV-C1(具體制備方法見ZhangM，XiaoZ，HuY，Sun L.Characterizationofamegalocytivirusfromculturedrockbream,Oplegnathus fasciatus(Temminck&Schlege)，inChina.AquacRes.2012;43:556 _64)于PBS中稀釋 至106copies/ml，即為病毒懸液。
[0031] 步驟3)攻毒感染
[0032] 在上述步驟1)注射后第5小時(shí)，將A和B組的每條魚注射100ul上述步驟2)的 病毒懸液。在感染后6天，取魚脾臟和腎臟組織。利用DNA提取試劑盒（購(gòu)于天根生化科 技（北京）有限公司"）從組織中提取DNA，用絕對(duì)定量PCR法檢測(cè)組織中病毒含量（具體 方法見上述參考文獻(xiàn)）。結(jié)果表明，A組魚脾臟和腎臟的病毒數(shù)（分別為2xl04和8x103)顯 著（P〈〇.01)低于B組魚脾臟和腎臟的病毒數(shù)（分別為lxlO5和2x10 4)。
[0033] 這些結(jié)果表明，前胸腺素a能夠顯著增強(qiáng)魚類抵抗病毒的侵染。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種魚類前胸腺素 α重組蛋白，其特征在于：魚類前胸腺素 α重組蛋白為 半滑舌鰨的前胸腺素 α重組蛋白，其是以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進(jìn) 行PCR擴(kuò)增前胸腺素 α基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化即為重組蛋白，所述Fl為 5' -GATATCATGGCGGACAGCAAAG-3' ；R1 為 5' -GATATCCTGGTCTGTCTTCTGCT-3'。
2. -種權(quán)利要求1所述的魚類前胸腺素 α重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于：所述半滑舌 鰨的前胸腺素 α重組蛋白可應(yīng)用于制備抑制抗病毒的制劑。
3. 權(quán)利要求2所述的魚類前胸腺素 α重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于：所述病毒為細(xì)胞 腫大病毒。
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種魚類(半滑舌鰨)前胸腺素α及其應(yīng)用。魚類前胸腺素α重組蛋白為半滑舌鰨的前胸腺素α重組蛋白，其是以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物F1和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增前胸腺素α基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化即為重組蛋白。本發(fā)明前胸腺素α蛋白注射魚類后能夠顯著提高魚類的抗病毒能力。
【IPC分類】A61K38-22, A61P31-20, C07K14-575
【公開號(hào)】CN104650218
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510096179
【發(fā)明人】孫黎, 張寶存
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院海洋研究所
【公開日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2015年3月4日