一種提高依諾肝素純度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本法說(shuō)明涉及一種提取提純制備原料藥的方法，屬于化學(xué)領(lǐng)域，具體是一種制備高純度精品依諾肝素。
【背景技術(shù)】
[0002]依諾肝素是由豬或牛的腸粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽，屬粘多糖類(lèi)物質(zhì)，在動(dòng)物體內(nèi)多以依諾肝素-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形式存在。醫(yī)學(xué)上，依諾肝素在體內(nèi)外均有抗凝血作用，可延長(zhǎng)凝血時(shí)間、凝血酶原時(shí)間和凝血酶時(shí)間。臨床上具有抗凝血、降血脂、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抗血小板積聚和釋放、促纖溶、抑制動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、降低血液粘度和抗炎等作用。
[0003]2008年2月11日，美國(guó)因注射依諾肝素出現(xiàn)4例死亡，350多例不良反應(yīng)，成為轟動(dòng)世界的“依諾肝素事件”。經(jīng)過(guò)專(zhuān)家論證，上述死亡和不良反應(yīng)是由于依諾肝素中含有多硫酸軟骨素所致。多硫酸軟骨素是類(lèi)肝素的一種，其性質(zhì)與依諾肝素基本相似，經(jīng)過(guò)檢測(cè)與依諾肝素的區(qū)別是:1、依諾肝素是右旋結(jié)構(gòu)；而多硫酸軟骨素是左旋結(jié)構(gòu)；2、所含陰離子強(qiáng)度有差異。3、多硫酸軟骨素經(jīng)檢測(cè)比依諾肝素的分子量大。
[0004]國(guó)際依諾肝素供應(yīng)商對(duì)此相當(dāng)重視，因此我公司一直致力于此項(xiàng)研究中，收獲多多。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種萃取法分離依諾肝素中的多硫酸軟骨素的方法，是為了攻克國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家關(guān)于依諾肝素中的多硫酸軟骨素不能分離的定論，利用多硫酸軟骨素的性質(zhì)，用離子交換樹(shù)脂交換和乙醇沉淀，從而實(shí)現(xiàn)用萃取法將依諾肝素與多硫酸軟骨素徹底分離。
[0006](I)本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種制備高純度依諾肝素的工藝，其步驟如下:將粗品依諾肝素溶入飲用水中，攪拌5-10小時(shí)，將其全部溶解；
(2)將步驟(I)中溶解液，用鹽酸溶液調(diào)PH至7.0-8.0，然后升溫至50-55°C之間時(shí)加入5-15g/億單位胃蛋白酶，再加入5-25g/億單位胰酶，保溫2-4小時(shí)；
(3)將步驟(2)中酶解液在30?40分鐘內(nèi)升溫至85-90°C，靜止10-30分鐘，攪拌，然后等降溫至50-55°C時(shí)，用l-3mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)PH至10.0-12.0，靜止20-30小時(shí)，分層，過(guò)濾，留上清液待沉淀，下層沉淀放離心機(jī)離心，離心后留上層離心液；
(4)待步驟(3)中上清液和離心液用弱堿性離子交換樹(shù)脂吸附，用0.3-0.4g/L的氯化鈉洗脫，連續(xù)洗脫兩遍；
(5)取步驟(4)中洗脫液，用2-6mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)PH至10.0-12.0，然后加入3_5%雙氧水，氧化10-12小時(shí)；
(6)將步驟(5)中溶液用70-75%乙醇沉淀，再加入20-30g/L氯化鈉溶液，靜止沉淀10-12小時(shí)，取沉淀物，用70-75%乙醇溶解，靜置24-30小時(shí)，棄去上層液，將不銹鋼砂芯棒放在產(chǎn)品中，用真空泵通抽干； (7)將步驟(6)中產(chǎn)品放在真空干燥箱中，烘干70-80小時(shí)，得產(chǎn)品。
有益效果:
[0007](I)本發(fā)明結(jié)合升溫氧化結(jié)合多種物理提取方法并純化得到效價(jià)高于180U/mg，收率高于80%的高純度依諾肝素。(2)通過(guò)升溫補(bǔ)加雙氧水可以有效的控制依諾肝素氧化失活，并且實(shí)現(xiàn)了氧化與脫色同步進(jìn)行。(3)依據(jù)依諾肝素及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的極性差異，在氯化鈉溶液中用離子交換樹(shù)脂，再用乙醇沉淀洗脫，最后得到依諾肝素產(chǎn)品。工藝采用的方法，使得多硫酸軟骨素雜質(zhì)被萃取，而依諾肝素產(chǎn)品留在了低鹽溶液中，用乙醇沉淀，極大地提高了收率，最終得到的依諾肝素產(chǎn)品達(dá)到中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)，并且經(jīng)測(cè)不含多硫酸軟骨素成分。
【具體實(shí)施方式】
[0008]實(shí)施例1
將50g粗品依諾肝素溶入飲用水中，攪拌5小時(shí)，將其全部溶解；將溶解液用鹽酸溶液調(diào)PH至7.0，然后升溫至50°C之間時(shí)加入5g/億單位胃蛋白酶，再加入5g/億單位胰酶，保溫2小時(shí)；將酶解液在30分鐘內(nèi)升溫至85°C，靜止10分鐘，攪拌，然后等降溫至50°C時(shí)，用lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)PH至10.0,靜止20小時(shí)，分層，過(guò)濾，留上清液待沉淀，下層沉淀放離心機(jī)離心，離心后留上層離心液；待上清液和離心液用弱堿性離子交換樹(shù)脂吸附，用
0.3g/L的氯化鈉洗脫，連續(xù)洗脫兩遍。取洗脫液用2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)PH至10.0，然后加入3%雙氧水，氧化10小時(shí)；將溶液用70%乙醇沉淀，再加入20g/L氯化鈉溶液，靜止沉淀10小時(shí)，取沉淀物，用70%乙醇溶解，靜置24小時(shí)，棄去上層液，將不銹鋼砂芯棒放在產(chǎn)品中，用真空泵通抽干；將產(chǎn)品放在真空干燥箱中，烘干70小時(shí)，得產(chǎn)品。得到的產(chǎn)品經(jīng)檢測(cè)其效價(jià)為182U/mg，回收率為80.6%硫酸軟骨素為0.01mg/mL硫酸皮膚素為0.01mg/mL,各項(xiàng)指標(biāo)均均符合中國(guó)藥典要求。
實(shí)施例2
[0009]將50g粗品依諾肝素溶入飲用水中，攪拌7小時(shí)，將其全部溶解；將溶解液用鹽酸溶液調(diào)PH至6.0，然后升溫至53°C之間時(shí)加入13g/億單位胃蛋白酶，再加入16g/億單位胰酶，保溫3小時(shí)；將酶解液在36分鐘內(nèi)升溫至87 V，靜止20分鐘，攪拌，然后等降溫至53 °C時(shí)，用2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)PH至11.0，靜止26小時(shí)，分層，過(guò)濾，留上清液待沉淀，下層沉淀放離心機(jī)離心，離心后留上層離心液；待上清液和離心液用弱堿性離子交換樹(shù)脂吸附，用0.36g/L的氯化鈉洗脫，連續(xù)洗脫兩遍。取洗脫液用4mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)PH至11.0,然后加入4%雙氧水，氧化11小時(shí)；將溶液用73%乙醇沉淀，再加入26g/L氯化鈉溶液，靜止沉淀11小時(shí)，取沉淀物，用73%乙醇溶解，靜置27小時(shí)，棄去上層液，將不銹鋼砂芯棒放在產(chǎn)品中，用真空泵通抽干；將產(chǎn)品放在真空干燥箱中，烘干75小時(shí)，得產(chǎn)品。得到的產(chǎn)品經(jīng)檢測(cè)其效價(jià)為210U/mg，回收率為86.1%硫酸軟骨素為0.001mg/mL硫酸皮膚素為0.0Olmg/mL,各項(xiàng)指標(biāo)均均符合中國(guó)藥典要求。
實(shí)施例3
[0010]將50g粗品依諾肝素溶入飲用水中，攪拌10小時(shí)，將其全部溶解；將溶解液用鹽酸溶液調(diào)PH至8.0，然后升溫至55°C之間時(shí)加入15g/億單位胃蛋白酶，再加入25g/億單位胰酶，保溫4小時(shí)；將酶解液在40分鐘內(nèi)升溫至85-90°C，靜止30分鐘，攪拌，然后等降溫至55°C時(shí)，用l-3mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)PH至12.0，靜止30小時(shí)，分層，過(guò)濾，留上清液待沉淀，下層沉淀放離心機(jī)離心，離心后留上層離心液；待上清液和離心液用弱堿性離子交換樹(shù)脂吸附，用0.4g/L的氯化鈉洗脫，連續(xù)洗脫兩遍。取洗脫液用2-6mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)PH至12.0，然后加入5%雙氧水，氧化12小時(shí)；將溶液用75%乙醇沉淀，再加入30g/L氯化鈉溶液，靜止沉淀12小時(shí)，取沉淀物，用70-75%乙醇溶解，靜置30小時(shí)，棄去上層液，將不銹鋼砂芯棒放在產(chǎn)品中，用真空泵通抽干；將產(chǎn)品放在真空干燥箱中，烘干80小時(shí)，得產(chǎn)品。得到的產(chǎn)品經(jīng)檢測(cè)其效價(jià)為185U/mg，回收率為83%硫酸軟骨素為0.005mg/mL硫酸皮膚素為0.01mg/mL，各項(xiàng)指標(biāo)均均符合中國(guó)藥典要求。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種提高依諾肝素純度的方法，其特征在于:用離子交換樹(shù)脂的方法以及乙醇提純?nèi)コ乐Z肝素中的多硫酸軟骨素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其工藝的具體步驟如下: 將粗品依諾肝素溶入飲用水中，攪拌5-10小時(shí)，將其全部溶解； 將步驟(I)中溶解液，用鹽酸溶液調(diào)PH至7.0-8.0，然后升溫至50-55°C之間時(shí)加入5_15g/億單位胃蛋白酶，再加入5-25g/億單位胰酶，保溫2-4小時(shí)； 將步驟(2)中酶解液在30?40分鐘內(nèi)升溫至85-90°C，靜止10-30分鐘，攪拌，然后等降溫至50-55°C時(shí)，用l-3mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)PH至10.0-12.0,靜止20-30小時(shí)，分層，過(guò)濾，留上清液待沉淀，下層沉淀放離心機(jī)離心，離心后留上層離心液； 待步驟(3)中上清液和離心液用弱堿性離子交換樹(shù)脂吸附，用0.3-0.4g/L的氯化鈉洗脫，連續(xù)洗脫兩遍； 取步驟(4)中洗脫液，用2-6mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)PH至10.0-12.0，然后加入3_5%雙氧水，氧化10-12小時(shí)； 將步驟(5)中溶液用70-75%乙醇沉淀，再加入20-30g/L氯化鈉溶液，靜止沉淀10-12小時(shí)，取沉淀物，用70-75%乙醇溶解，靜置24-30小時(shí)，棄去上層液，將不銹鋼砂芯棒放在產(chǎn)品中，用真空泵通抽干； 將步驟(6)中產(chǎn)品放在真空干燥箱中，烘干70-80小時(shí)，得產(chǎn)品。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種提高依諾肝素純度的方法，這種方法屬于化學(xué)領(lǐng)域。主要包括用離子交換樹(shù)脂交換，乙醇提純等解決了目前依諾肝素生產(chǎn)過(guò)程中混有多硫酸軟骨素的問(wèn)題。工藝簡(jiǎn)單，易操作，節(jié)約了成本，提高了依諾肝素的純度，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【IPC分類(lèi)】C08B37-10
【公開(kāi)號(hào)】CN104650261
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410813467
【發(fā)明人】劉冠男, 周曉娜, 夏襯來(lái)
【申請(qǐng)人】青島九龍生物醫(yī)藥有限公司
【公開(kāi)日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2014年12月24日