一種強化酶解法提取煙葉木質(zhì)素的預(yù)處理方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及木質(zhì)素提取領(lǐng)域，更具體地，涉及一種強化酶解法提取煙葉木質(zhì)素的 預(yù)處理方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著煙草工業(yè)的不斷發(fā)展，吸煙與健康問題備受關(guān)注，降焦減害成了煙草工業(yè)發(fā) 展的必然趨勢。而煙葉中的木質(zhì)素是煙焦油中稠環(huán)芳烴類、芳香胺等有害物質(zhì)的主要來源。 研宄表明，木質(zhì)素的熱裂解產(chǎn)物主要含有甲氧基、羥基和烷基的苯酚類物質(zhì)（木質(zhì)素快速 熱裂解試驗研宄.2005, 39(5) : 710-714)。卷煙在吸燃的過程中，煙草中的木質(zhì)素完全有可 能會裂解產(chǎn)生具有促癌作用的各種酚類物質(zhì)。研宄煙草木質(zhì)素在卷煙吸燃條件下的熱裂解 機理可以對于卷煙的降焦減害提供新的思路。而研宄煙草木質(zhì)素的熱裂解之前，必須從煙 草中分離結(jié)構(gòu)變化較小的木質(zhì)素。
[0003] 從植物中分離木質(zhì)素的方法有很多，傳統(tǒng)的分離木質(zhì)素的方法是采用硫酸將植物 原料中的碳水化合物水解，而木質(zhì)素作為不溶物分離得到，然而，在濃硫酸的作用下，木質(zhì) 素會縮合降解，結(jié)構(gòu)發(fā)生較大的變化。有機溶劑法是利用有機溶劑將煙草中的木質(zhì)素溶解 而實現(xiàn)將木質(zhì)素的分離目的，而煙草中的木質(zhì)素含量很少，有機雜質(zhì)多，所以機溶劑法分離 煙草木質(zhì)素存在收率低和有機雜質(zhì)含量多等缺陷。
[0004] 纖維素酶解法分離木質(zhì)素是近年來發(fā)展的一種新的分離木質(zhì)素方法，利用纖維 素酶將煙葉中的纖維素和半纖維素酶水解成水溶性單糖，從而分離提取木質(zhì)素。酶解 法具有分離條件溫和，木質(zhì)素結(jié)構(gòu)改變較小等優(yōu)點，為木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)研宄提供很好的原 料。Wu S.和Argyropolos D. S.等采用酶解的方法分離木質(zhì)素，結(jié)果表明這種方法得到 的酶解木質(zhì)素和磨木木質(zhì)素沒有顯著的區(qū)別，結(jié)構(gòu)變化小（Journal ofpulp and paper science，2003, 29(7) :235-240)。但是，由于煙葉中的木質(zhì)素含量較低，而果膠、蛋白質(zhì)、淀 粉、油脂等有機質(zhì)的含量較高，纖維素和木質(zhì)素的緊密結(jié)合，以及半纖維素的對纖維素的包 裹作用，使得纖維素酶解法分離木質(zhì)素存在酶解效率低的問題，從而導(dǎo)致殘留少量纖維素 雜質(zhì)。因此提高纖維素酶解效率成為了該方法的關(guān)鍵。
[0005] 近幾年也有不少學(xué)者通過研宄不同的預(yù)處理方法來提高木質(zhì)纖維素的酶解效 率。但現(xiàn)有的預(yù)處理方法均存在各種不足（Curr Opin Biotechnol, 2009, 20:339-347)。 例如：（1)蒸汽爆破：該方法是在幾十個大氣壓下，150~240°C飽和水蒸氣中經(jīng)幾十秒至 幾分鐘的瞬間處理之后，立即降至常壓，經(jīng)過膨爆的楊木經(jīng)24h的纖維素酶處理可以達到 90%以上的消化率，但是高溫高壓下的飽和水蒸氣使木質(zhì)素的X-丙烯乙醚及部分B-丙 烯乙醚裂開，破壞木質(zhì)素。（2)稀酸預(yù)處理：酸蒸氣膨爆催化是研宄最細的一種處理方法， 在高溫和酸的條件下蒸汽膨爆后木質(zhì)素結(jié)構(gòu)變化并不十分清楚，但是原來的結(jié)構(gòu)很明顯 改變了，使得木質(zhì)素變得更加容易聚集。（3)堿預(yù)處理：雖然大多數(shù)的堿預(yù)處理都可以提 高酶解效率，但是依然會存在脫木質(zhì)素的問題，氨膨爆是一種典型物理化學(xué)堿預(yù)處理，但 水解率一般只有40%~50%。肌6?61111(.(：.等研宄了恥011(0.5~10%，901：，111)，稀硫 酸（0. 5~6. 0%，121°C，lh)和熱水（100°C，lh)三種預(yù)處理對酶水解效率的影響。實驗 結(jié)果表明采用NaOH預(yù)處理后，柳枝稷的葡萄糖產(chǎn)生率比其他兩種預(yù)處理方法高，但是木質(zhì) 素的剩余率只有1/3左右，所以大部分的木質(zhì)素在這個過程中發(fā)生了降解。（Holzforschu ng，1975, 29 (5) : 153-159)。也有相關(guān)的專利報導(dǎo)利用離子液體或者超聲輔助提高木質(zhì)纖維 素的酶解糖化效率（CN102154412A，CN101979642A，CN102533907A)。由于上述預(yù)處理方法 都是基于提高糖的轉(zhuǎn)化率為目的，而忽略了木質(zhì)素在預(yù)處理過程中的結(jié)構(gòu)變化和木質(zhì)素損 失導(dǎo)致收率低等問題。
[0006] 用于酶解法提取煙葉木質(zhì)素的預(yù)處理方法主要有丙酮抽提（Journal ofpulp and paper science, 2003, 29(7) : 235-240)，但是耗時太長（48h);另外，苯 /甲苯一乙醇/乙醚的混合溶劑也常用于提取木質(zhì)素的預(yù)處理（Industrial Crops Products.，2010, 32:551-559)。上述有機溶劑預(yù)處理方法不但耗時、危險，且對煙葉的預(yù)處 理效果也有待提尚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了能提高酶解的效率，本發(fā)明首先提供一種強化酶解法提取煙葉木質(zhì)素的預(yù)處 理方法，包括以下步驟，將干燥的煙葉粉分散到氫氧化鈉、尿素和水的混合水溶液中，攪拌， 過濾，洗滌至濾液為中性，干燥，得預(yù)處理后的煙葉粉。
[0008] 所述的干燥的煙葉粉的粒徑為60~100目。
[0009] 所述混合水溶液，按重量百分比計，氫氧化鈉的含量為5~10%，尿素的含量為 10~15%，余量為水。
[0010] 所述的分散的溫度為-15~8°C。
[0011] 更進一步提供一種強化酶解法提取煙葉木質(zhì)素的方法，將預(yù)處理后的煙葉粉分散 于緩沖溶液中，加入纖維素酶，在45~60°C溫度下反應(yīng)8~96h，得水解液，
[0012] 所述的預(yù)處理為上述的預(yù)處理方法，
[0013] 所述的纖維素酶的加入量為，以煙葉粉中的葡聚糖含量計，5~30FPU/g。
[0014] 所述的緩沖溶液為醋酸-醋酸鈉緩沖液，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液或磷酸鹽緩沖 液，pH = 4. 5~6. 0,離子強度為25~100mmol/L。
[0015] 所述的煙葉粉的質(zhì)量和緩沖液的體積比為1~4:40~80g/ml。
[0016] 所述的緩沖溶液為醋酸-醋酸鈉緩沖液，緩沖溶液pH = 4. 8~5. 5,離子強度為 50mmol/L〇
[0017] 本發(fā)明的原理：
[0018] 樣品經(jīng)過氫氧化鈉/尿素處理液預(yù)處理過程提高酶解效率的機理是：在低溫下能 夠氫氧化鈉水合物與纖維素上羥基通過氫鍵驅(qū)動自組裝形成包合物，從而破壞纖維素原有 的分子內(nèi)和分子間氫鍵，由此把部分纖維素分子帶入水溶液中，同時該條件下也可以除去 了煙草中的水溶性糖、蛋白質(zhì)，游離性半纖維素和其他游離雜質(zhì)，降低纖維素結(jié)晶度，但是 與植物細胞壁聯(lián)接的木質(zhì)素網(wǎng)絡(luò)卻不溶于這個溶劑體系。綜上幾個因素，都有利于在酶解 過程中，提高煙葉的頑抗性以及纖維素酶對纖維素的可及性，從而提高煙葉的酶解效率。
[0019] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和效果：
[0020] 1)本發(fā)明的預(yù)處理方法能夠明顯提高木質(zhì)素的酶解效率，有利于后續(xù)煙葉木質(zhì)素 的提取和含量測定。
[0021] 2)本發(fā)明方法預(yù)處理條件是在低溫（_15°C~-8°c )條件下進行，避免了傳統(tǒng)方法 對原料中木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的影響以及木質(zhì)素的溶出損失。
[0022] 3)本發(fā)明方法使用試劑均無毒無污染，操作簡單高效，使用試劑價格低廉易得。
【附圖說明】
[0023] 圖1是實施例1的預(yù)處理濾液的紫外吸收光譜對比圖
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明采用 的試劑、設(shè)備和方法為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)市購的試劑、設(shè)備和常規(guī)使用的方法。實施例1
[0025] 稱取10g煙葉粉，在_10°C的條件下將煙葉粉分散于250ml氫氧化鈉、尿素和水的 混合溶液中，混合溶液中氫氧化鈉、尿素和水的質(zhì)量比為7:12:81。在維持-10°C的條件下 攪拌30min后，用600目的濾布進行過濾，保留濾液A用于紫外測試。并用純水將固體洗 滌至中性，在50°C真空干燥24h得到預(yù)處理煙葉粉3. 6738g。采用美國國家可再生能源實 驗室分析測試方法測定預(yù)處理煙葉的纖維素含量（NREL/TP-510-42618, Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass. 2008)。稱取 lg上述預(yù)處理后的煙葉 粉，加入到50mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，pH為4. 8,離子強度為50mmol/L，再加入20FPU/ g葡聚糖的纖維素酶（CTec2,諾維信中國生物技術(shù)有限公司提供），在50°C溫度下反應(yīng)72h。 反應(yīng)結(jié)束后，固液分離獲得糖類化合物水解液，通過生物傳感分析儀測定葡萄糖含量，計算 得到酶解效率為99. 48%。
[0026] 圖1是采用紫外可見分光光度計（廠家：日本島津公司，型號：UV_2450)對本實施 例預(yù)處理所制的濾液進行掃描得到的紫外吸收光譜對比圖，由圖1可知：經(jīng)冷凍至-10°c的 氫氧化鈉/尿素體系在211nm和239nm處有兩個明顯的吸收峰，加入木質(zhì)素后239nm處的 吸收峰明顯增強；而濾液A的紫外吸收峰是在201nm，在240nm附近沒有明顯的吸收峰。這 表明濾液A中不含有木質(zhì)素，所以該方法預(yù)處理不會導(dǎo)致煙葉中木質(zhì)素的溶出，從而提高 木質(zhì)素的提取率。
[0027] 另外，濾液A的紫外吸收峰藍移可能與尿素分子和氫氧化鈉水合物與煙葉溶出物 形成包合物有關(guān)。因為尿素分子和氫氧化鈉水合物可以通過氫鍵包合淀粉、醇類、有機酸等 物質(zhì)（Macromolecules, 2008, 41:9345 - 9351) 〇
[0028] 實施例2