一種腸膜明串珠菌凍干制劑及其制備方法和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腸膜明串珠菌凍干制劑及其制備方法和 應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 明串珠菌（Leuconostoc)是一類乳品生產(chǎn)中重要的商業(yè)化乳酸菌株，屬于革蘭氏 陽性菌。研宄表明，明串珠菌具有調(diào)節(jié)腸道紊亂、代謝果糖生成甘露醇、合成K族維生素、水 解a-半乳糖苷、產(chǎn)細菌素等益生功能，同時有助于形成干酪孔眼、產(chǎn)生風味物質(zhì)。此外， 明串珠菌可在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，利用蔗糖為底物合成右旋葡聚糖（dextran，多糖的一 種），具有增粘、穩(wěn)定、乳化水體系以及持水性等特性，可見，明串珠菌的功能受到食品行業(yè) 廣泛的重視與認同，而明串珠菌凍干制劑的制備將進一步推動其在食品工業(yè)的應用。
[0003] 真空冷凍干燥技術(shù)是將濕物料或溶液在較低的溫度（一般為一 10°C~一 50°C ) 下凍結(jié)成固態(tài)，然后在真空條件下使其中的水分不經(jīng)液態(tài)直接升華成氣態(tài)，最終使物料脫 水的干燥技術(shù)，乳酸菌可通過這種干燥技術(shù)保持較高的生理特性，并可直接投入食品生產(chǎn) 中。為了增強菌株在凍干過程中的存活性能，除了對凍干工藝的優(yōu)化外，凍干保護劑的選擇 也是影響乳酸菌干燥過程中細胞穩(wěn)定性的重要外部因素。目前，常用的凍干保護劑有海藻 糖、乳糖、蔗糖、D-山梨醇、脫脂奶粉、糊精等，而凍干工藝通常為菌種的培養(yǎng)、離心收集、添 加保護劑制備菌體的懸浮液、預凍、真空冷凍干燥?？梢姡F(xiàn)有乳酸菌凍干制劑的制備所涉 及的配方復雜（一個配方往往會涉及多種凍干保護劑），工藝繁瑣（通常需要乳酸菌預先培 養(yǎng)收集后重懸于無菌的凍干保護液中，再經(jīng)預凍、冷凍干燥獲得凍干的乳酸菌制劑），而復 雜的配方和繁復的操作大大增加了活菌制劑在制備過程中被污染的風險，進而對消費者形 成了潛在的威脅。此外，隨著生活質(zhì)量的不斷提高，與我們每個人日常生活息息相關(guān)的乳酸 菌制劑所采用的凍干保護劑（糊精等）的食品安全問題越來越受到消費者的重視，因此，尋 找來源天然、操作簡便、存活率高、保存穩(wěn)定性佳的新型乳酸菌凍干制劑的制備方法將是未 來乳酸菌凍干制劑制備的重要研宄方向之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 因此，本發(fā)明為了解決目前缺乏來源天然、操作簡便、益生菌存活率高、保存穩(wěn)定 性佳的腸膜明串珠菌凍干制劑的問題，提供了一種腸膜明串珠菌凍干制劑及其制備方法和 應用。
[0005] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由于現(xiàn)有腸膜明串珠菌凍干制劑的制備所涉及的配方相當復雜， 正如背景部分所述，包括海藻糖、乳糖、蔗糖、D-山梨醇、脫脂奶粉、糊精等等，由于凍干制劑 的配方復雜，對植腸膜明串珠菌凍干制劑原料的安全性提出了更高的要求，同時大大增加 了在制備過程中產(chǎn)生污染的風險，進而對消費者構(gòu)成了潛在的威脅，這種現(xiàn)狀與當前消費 者日益增強的食品安全意識構(gòu)成了極大的矛盾和沖突，為了解決這一矛盾，發(fā)明人對乳酸 菌特別是腸膜明串珠菌的培養(yǎng)方式，包括培養(yǎng)基的選擇，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度、時間等一系列技 術(shù)參數(shù)進行了認真的分析和篩選，最終得到了本發(fā)明所述的技術(shù)方案以及所得腸膜明串珠 菌凍干制劑的原料來源天然，其制備方法工藝簡便，所得腸膜明串珠菌凍干制劑中菌株存 活率高、保存穩(wěn)定性佳的技術(shù)效果。
[0006] 因此，為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一是：一種腸膜明串珠菌凍 干制劑的制備方法，包括以下步驟：
[0007] (1)將腸膜明串珠菌（L.mesenteroides)接種于番前汁鹿糖培養(yǎng)基中，所述番前 汁蔗糖培養(yǎng)基中蔗糖的質(zhì)量百分比濃度為5-20%，其余為番茄汁，20-35°C，100-300rpm振 蕩培養(yǎng)8-48小時，獲得發(fā)酵液；
[0008] (2)將步驟⑴所得發(fā)酵液的pH值調(diào)節(jié)至6. 5-7. 5,冷凍干燥即得。
[0009] 其中步驟（1)是將腸膜明串珠菌（L. mesenteroides)接種于番前汁鹿糖培養(yǎng)基 中，所述番茄汁蔗糖培養(yǎng)基中蔗糖的質(zhì)量百分比濃度為5-20%，其余為番茄汁，20-35°C， 100-300rpm振蕩培養(yǎng)8-48小時，獲得發(fā)酵液。其中所述腸膜明串珠菌較佳地為：腸膜明 串珠菌BD1710,腸膜明串珠菌LM57或腸膜明串珠菌LM79。上述幾種腸膜明串珠菌的菌株 為現(xiàn)有技術(shù)，其制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，或者通過購買獲得。其中所述番茄汁蔗 糖培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)的番茄汁蔗糖培養(yǎng)基，該番茄汁蔗糖培養(yǎng)基較佳地由包括以下步驟 的方法制備：清洗成熟番茄，去皮榨汁，將所得榨汁過濾后煮沸，離心取上清，加入蔗糖加熱 溶解后冷卻，調(diào)節(jié)pH值，滅菌后冷卻即得。其中所述過濾的方法較佳地為利用100目紗布 過濾取汁，所述煮沸的時間較佳地為1-10分鐘，所述離心的速度較佳地為4, 000-12, 000g， 離心的時間較佳地為8-12分鐘，蔗糖的加入量較佳地為5-20%，所述滅菌的溫度較佳地為 110-135°C，滅菌時間較佳地為10-30分鐘，pH值較佳地為6. 5-7. 5。其中所述培養(yǎng)的溫度 較佳地為25-30°C，更佳地為28°C，震蕩的速度較佳地為150-200rpm，更佳地為180rpm，培 養(yǎng)的時間較佳地為26-45小時，更佳地為40小時。
[0010] 其中步驟（2)是將步驟（1)所得發(fā)酵液的pH值調(diào)節(jié)至6. 5-7. 5,冷凍干燥即得。 其中所述調(diào)節(jié)pH值的方法為本領(lǐng)域常規(guī)方法，較佳地為利用食品級堿調(diào)節(jié)pH值，所述食品 級堿為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地是：Na 2C03、NaHC0#P NaOH中的一種或多種。
[0011] 本發(fā)明所述的凍干為本領(lǐng)域常規(guī)的凍干方法，所述凍干方法較佳地為真空冷凍干 燥，其中所述真空冷凍干燥條件較佳地為：板層極限溫度< _60°C，冷阱極限溫度-70°C，板 層裝料厚度〇? 5~2. Ctam，真空度10~30Pa〇
[0012] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之二是：一種腸膜明串珠菌凍干制 劑，所述腸膜明串珠菌凍干制劑由包括以下步驟的方法制備而得：
[0013] (1)將腸膜明串珠菌（L. mesenteroides)接種于番前汁鹿糖培養(yǎng)基中，2〇-35°C， 100-300rpm振蕩培養(yǎng)8-48小時，獲得發(fā)酵液；
[0014] (2)將步驟（1)所得發(fā)酵液的pH值調(diào)節(jié)至6. 5-7. 5,冷凍干燥即得。
[0015] 其中各步驟所述技術(shù)特征的優(yōu)選范圍與上文所述腸膜明串珠菌凍干制劑的制備 方法中相應的內(nèi)容完全一致。
[0016] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之三是：一種如上所述腸膜明串珠 菌凍干制劑在制備食品或膳食添加劑中的應用。
[0017] 本發(fā)明所述的應用為本領(lǐng)域常規(guī)的應用，所述應用較佳地包括利用本發(fā)明所述腸 膜明串珠菌凍干制劑制備發(fā)酵食品，乳制品中的用途，或者將所得腸膜明串珠菌凍干制劑 作為膳食添加劑或營養(yǎng)添加劑等用途。
[0018] 在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實 例。
[0019] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0020] 本發(fā)明的積極進步效果在于：
[0021] 1、本發(fā)明所述腸膜明串珠菌凍干制劑的制備方法采用的原料來源天然，與現(xiàn)有的 凍干制劑技術(shù)所用的復合配方相比，制備獲得的凍干制劑具有更高的食品安全性；
[0022] 2、本發(fā)明所述腸膜明串珠菌凍干制劑的制備方法工藝簡便，一方面省略了傳統(tǒng)凍 干制劑制備工藝中菌體收集的步驟，最大程度上減少了菌體收集時造成的機械損傷；另一 方面，省去了后續(xù)凍干保護劑的復配與菌體重懸的步驟，大大降低了凍干制劑制備過程中 污染的可能性。
[0023]3、采用本發(fā)明的制備方法獲得的腸膜明串珠菌凍干制劑中菌株存活率高、保存穩(wěn) 定性佳，其可作為一種新型的制備方法應用于腸膜明串珠菌凍干制劑工業(yè)化生產(chǎn)及相關(guān)領(lǐng) 域中，應用前景十分廣闊。
【具體實施方式】
[0024] 下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實 施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說明書選擇。本發(fā)明中所述的室溫是指進行試驗的操作間的溫度，一般為15-25°C。
[0025] 實施例1腸膜明串珠菌凍干制劑的制備與存活率、活菌數(shù)的測定
[0026] 1、材料與方法
[0027] 番茄汁蔗糖培養(yǎng)基的制備：成熟番茄清洗，去皮，榨汁機壓榨，100目紗布過濾取 汁，煮沸5min，8000g離心10min取上清，加入15% (w/v)鹿糖加熱溶解后冷卻至室溫，以食 用級堿調(diào)節(jié)pH至7. 0,121°C滅菌20min，冷卻至室溫，即得無菌的番茄汁蔗糖培養(yǎng)基。
[0028] 種子（發(fā)酵菌種）的制備：
[0029] 將L. mesenteroides BD1710 (所述腸膜明串珠菌的保藏編號為CGMCCNo. 6432,該 菌株的來源請參見公開號為CN 103013891A的中國專利）的凍干粉用少量無菌蒸餾水溶 解，用接種環(huán)取一環(huán)劃線于含2% (w/v)鹿糖的M17瓊脂培養(yǎng)基（Merck Co.德國）上，28°C 好氧培養(yǎng)24h取出，用接種環(huán)挑取單菌落放入20mL含2% (w/v)蔗糖的M17液體培養(yǎng)基 (Merck Co.德國），28°C 180rpm搖床培養(yǎng)24h取出，培養(yǎng)物9,000rpm離心10分鐘，棄去上 清，菌體用無菌蒸餾水洗滌2次后，用原培養(yǎng)體積的無菌蒸餾水懸浮，得到發(fā)酵用的種子。
[0030] 2、腸膜明串珠菌凍干制劑的制備
[0031] (1)將所得L. mesenteroidesBD1710的種子按接種量2 % (v/v)無菌接種于 PH7.0、蔗糖濃度為15% (w/v)的番茄汁蔗糖培養(yǎng)基中，28°C、180rpm振蕩培養(yǎng)24小時，獲 得發(fā)酵液。
[0032] (2)將發(fā)酵液以無菌的食用級堿液調(diào)節(jié)pH至7.0,冷凍干燥后即得BD1710的凍干 制劑S1。
[0033] 3、腸膜明串珠菌凍干制劑存活率、