tcggcccagggcctgatcacctgcaaggaggtgcacgagtggctggaga cctgcggctcggtggaggacttccccctgttcgaggccgtgtaccagatcgtgtacaacaactaccccatgaagaac ctgcccgacatgatcgaggagctggacctgcacgaggactaacacKlKaaacg cg
[0034] 其中下劃線為酶切位點Nhel和Pmac I。
[0035] (3)分別構(gòu)建目的基因表達載體
[0036] 合成的目的基因c-lpaat和c-gpdl連接在pUC58載體上，通過限制性內(nèi)切酶 Nhe I和PmacI進行雙酶切，獲得目的基因c-lpaat和c-gpdl，再連接到經(jīng)Nhe I和PmacI 雙酶切處理的萊茵衣藻表達載體PH124 (可參見ZL201110070784. 1)中，獲得pH-c-lpaat 和pH-c-gpdl。pH124載體中含有Hsp70A-RBCS2合成啟動子和RBCS2終止子，以及ble基 因，具有腐草霉素抗性和博來霉素抗性。
[0037] (4)將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)入萊茵衣藻中，使之整合到核基因組
[0038] 用基因槍法、電轉(zhuǎn)法或者珠磨法將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到細胞壁缺陷的萊茵衣藻 CC-849 (購買自美國衣藻藻種庫）中，包括兩種基因的單轉(zhuǎn)和共轉(zhuǎn)，在有氨芐和博來霉素抗 性的平板上進行篩選，挑選陽性藻株，進行PCR檢測、測序和表達產(chǎn)物分析，確定得到目的 片段插入成功的藻株。
[0039] (5)利用GC-MS篩選出脂肪酸含量較高的轉(zhuǎn)化株，對其脂肪酸含量和成分進行分 析
[0040] 培養(yǎng)所選擇的產(chǎn)油高的轉(zhuǎn)基因藻株至平臺期末期，離心收集冷凍干燥后取l〇mg 干藻粉，提取脂肪酸，確定總脂占干重的百分含量，用氣質(zhì)聯(lián)用分析脂肪酸組成，所有結(jié)果 均與野生型（萊茵衣藻CC-849)對照比較。
[0041] (6)轉(zhuǎn)化株和野生株生長測定
[0042] 在正常光照和溫度下培養(yǎng)（5)中篩選得到脂肪酸含量較高的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻和 野生型（萊茵衣藻CC-849)，每株藻設(shè)三個平行，每天或每隔一天測定一次細胞的光密度 值，制作它們的生長曲線，結(jié)果表明轉(zhuǎn)入c-lpaat或c-gpdl基因的轉(zhuǎn)基因藻生長與野生型 衣藻一致，說明導入基因未影響衣藻的正常生長，見圖5(注：細胞數(shù)單位為細胞數(shù)/mL)。其 中A1-14為轉(zhuǎn)入c-lpaat基因的轉(zhuǎn)基因藻；B1-15為轉(zhuǎn)入c-gpdl基因的轉(zhuǎn)基因藻；CC849為 細胞壁缺陷的萊茵衣藻CC-849。
[0043] 所述PCR檢測引物分別為：
[0044] c-lpaat-F :5'atggccatggccgccgccgccgt 3' ；SEQ ID NO:5
[0045] c-lpaat-R :5'ttacttctgcttctcctccacct 3' ；SEQ ID NO:6
[0046] PCR擴增c-gpdl基因的引物為：
[0047] c-gpdl-F :5'cgccgaccgcctgaacct 3' ；SEQ ID NO:7
[0048] c-gpdl-R :5'gccgcaggtctccagccact 3' ；SEQ ID NO:8
[0049] 本發(fā)明的有益效果為：
[0050] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果：
[0051] 1、本發(fā)明證明在萊茵衣藻中可將改造后的外源基因插入其基因組，得到產(chǎn)油量較 高的轉(zhuǎn)基因衣藻藻株，與化學誘變等方法相比為定向改變且減少人體危害，與RNAi方法相 比不影響藻株的正常生長；
[0052] 2、最后得到的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻不僅油脂積累增加，其油脂成分也發(fā)生變化，多不 飽和脂肪酸含量降低，使之不需要修飾即可作為生產(chǎn)生物柴油的原料，這大大提高了油脂 的質(zhì)量，可在商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)中降低生產(chǎn)成本；
[0053] 3、微藻產(chǎn)油的開發(fā)，代替了原有的第一代和第二代產(chǎn)油材料，如高等植物油，這大 大減少了與人爭地的現(xiàn)象，擴大了海洋等非陸地資源的利用；
[0054] 4、萊茵衣藻生長速度快，周期短，其生長曲線是"s"型，與細菌等微生物繁殖特點 相似，同時又有高等植物的特征，可進行光合作用，吸收生物柴油燃燒時產(chǎn)生的co 2，形成循 環(huán)利用，減緩溫室效應(yīng)；
[0055] 5、選用細胞壁缺陷型萊茵衣藻，降低了轉(zhuǎn)化難度，同時方便了脂肪酸的提取，減少 破碎細胞所需的生產(chǎn)成本；
【附圖說明】
[0056] 圖1 :微藻中脂肪酸合成路徑圖；
[0057] 圖2 :萊茵衣藻密碼子偏愛性；
[0058] 圖3 :目的基因酶切結(jié)果圖；
[0059] 圖4 :載體酶切結(jié)果圖；
[0060] 圖5 :轉(zhuǎn)基因衣藻生長趨勢圖；
[0061] 圖6:載體構(gòu)建圖；
[0062]圖7 :脂肪酸總量比較圖。
【具體實施方式】：
[0063] 實施例1 :萊茵衣藻中l(wèi)paat和gpdl基因相應(yīng)外源基因的改造和表達載體的構(gòu)建
[0064] 本實施例選用的藻株為萊茵衣藻 CC-849 (Chlamydomonas reinhardti CC-849) (購自美國衣藻藻種庫，Durham，NC27708USA)作為轉(zhuǎn)基因操作的受體，該藻株為細胞壁缺 陷型的萊茵衣藻品系。
[0065] 萊茵衣藻培養(yǎng)時使用的培養(yǎng)基為TAP培養(yǎng)基，1L培養(yǎng)基的配方如下：2.42g Tris，25mL4XBeijerinck salts(16g NH4Cl，2g CaCl2.2H20,4g MgS04.7H20 溶于水中， 定容至1L)，lmL 1M磷酸鉀緩沖液，lmL Trace微量元素混合液（11. 4g H3B03, 5. 6g MnCl2. 4H20, 22gZnS04. 7H20, 4. 99g FeS04. 7H20, 1. 61g CoCl2. 6H20, 1. 57g CuS04. 5H20, 1. lg(N H4)6Mo7024 . 4H20,50g Na2EDTA，溶于水中，20 重量體積％1(011 調(diào) pH6.5-6.8,定容至 1L)，溶 解到975mL水中，使用冰醋酸調(diào)pH6. 95-7. 05,定容至1L。
[0066] 萊茵衣藻培養(yǎng)條件如下：在溫度為22~25°C，光照為90 u E/m2/s條件下連續(xù)光照 培養(yǎng)，其生長周期為12天左右，最大藻細胞濃度為6~7X106cells/mL。
[0067] (1)外源基因的改造：
[0068]從 GenBank 中查找油菜 lpaat(GenBank :AY616009. 1，見 SEQ ID NO. 1)和釀酒酵 母8口(11(66仙31^:224454.1，見3￡〇10勵.2)，根據(jù)萊茵衣藻密碼子的偏愛性（見圖2)，更 改部分密碼子，兩端設(shè)計酶切位點，分別是Nhel和PmacI，同時考慮到使用的酶切位點，跟 目的片段中存在的相同酶切位點序列，得到適合在萊茵衣藻中表達的c-lpaat和c-gpdl片 段，送去基因公司合成（上海生工生物工程有限公司）。c-lpaat基因序列如SEQ ID N0:3 所示，c-gpdl基因序列如SEQ ID NO:4所示。
[0069] SEQ ID NO. 1 ： lpaat
[0070] atggcgatggcagcagcagcagtgattgtgcctttggggattctcttcttcatttctggcctcgttgtc aatctccttcaggcagtttgctatgtcctcattcgacctctgtctaagaacacatacagaaagatcaaccgtgtggt tgcagaaaccttgtggttggagcttgtctggatcgttgactggtgggctggagtcaagatccaagtgtttgctgatg atgagacctttaatcgaatgggcaaagagcatgctcttgtcgtttgtaatcaccgaagtgatattgattggctcgtg ggatggattctggctcagaggtcaggttgcctaggaagcgcattagctgtgatgaagaagtcttccaaatttcttcc agtcatcggctggtcaatgtggttctcggagtatctgtttctcgaaagaaattgggcaaaggatgaaagcactttaa agtcaggtcttcaacgcttgaacgacttcccacggcctttctggttagccctttttgtggagggaacccgtttcaca gaggcaaaacttaaagcagcacaagagtacgcagccacctctcagttgcctgtccctcgaaatgtgttgattcctcg caccaaaggttttgtgtcagctgttagtaacatgcgttcatttgtgccagccatatatgatatgaccgtggctattc caaaaacttctccacccccaacgatgctaagactattcaaaggacaaccttctgtggtgcatgttcacatcaagtgt ca