一種不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備(s)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的重組大腸桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶催化領(lǐng)域，更具體地涉及一種不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備（S)-4-氯-3-羥基丁 酸乙酯的重組大腸桿菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 光學(xué)純的（S) _4_ 氯-3-羥基丁 酸乙醋（Ethyl 4-chloro_3-hydroxyrate， (S)-CHBE)是一種重要的有機(jī)中間體，其最主要的用途是作為合成降膽固醇藥物阿托伐他 汀的前體化合物。其手性單一對(duì)映體（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯（(S)-CHBE)同樣可用于 其他很多活性藥物的合成，如羥甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)還原酶抑制劑和1，4_二氫吡啶 類0 _阻滯劑等。
[0003] 潛手性物質(zhì)4-氯乙酰乙酸乙醋（Ethyl 4-chloro_3-〇xobutanoate，C0BE)具有易 于合成且價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，以其為反應(yīng)底物進(jìn)行不對(duì)稱還原反應(yīng)獲?。⊿)-CHBE是非常經(jīng) 濟(jì)有效的制備途徑。
[0004] 目前，以C0BE不對(duì)稱還原制備手性CHBE的研宄已經(jīng)有很多的報(bào)道。主要制備方法 分為化學(xué)催化不對(duì)稱還原法和微生物法兩種。其中化學(xué)催化不對(duì)稱還原法所用催化劑包括 了價(jià)格昂貴的銠、釕等金屬，并且最終產(chǎn)率低，耗能高，污染大。相比之下，微生物催化法有 著反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)迅速，副產(chǎn)物產(chǎn)生少，產(chǎn)物的處理簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，因此越來(lái)越受到關(guān)注。 然而，由于微生物細(xì)胞內(nèi)存在的酶系復(fù)雜，往往催化產(chǎn)物的光學(xué)純度不高，同時(shí)需要輔酶的 加入提供反應(yīng)還原力。
[0005] 以重組的還原酶直接進(jìn)行催化反應(yīng)，需要按照化學(xué)劑量添加大量昂貴的輔酶 (NADH、NADPH)。因此，為了獲得高產(chǎn)量、高純度的（S)-CHBE，需要克隆脫氫酶基因?qū)崿F(xiàn)輔酶 的高效原位再生，以提供一種高效率的輔酶再生循環(huán)體系。Yasohara等人從400株酵母菌 中篩選得到一株Candida magnoliae菌株，在水/乙酸正丁醋體系中，以添加葡萄糖、NADP 和葡萄糖脫氫酶用于輔酶循環(huán)，最終產(chǎn)物（S)-CHBE在有機(jī)相的積累量可達(dá)550mM，產(chǎn)物的 光學(xué)純度對(duì)映體過(guò)量值（enantiomeric excess e.e)達(dá)到96%。然而，該最終產(chǎn)物積累量 和產(chǎn)物e. e值在本領(lǐng)域仍然并不理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的重組大 腸桿菌及其應(yīng)用，從而解決現(xiàn)有技術(shù)中的化學(xué)法催化產(chǎn)物的產(chǎn)率低，耗能高，污染大，微生 物法催化產(chǎn)物的產(chǎn)量低，光學(xué)純度不高，并且需要額外添加輔酶的缺陷。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] 提供一種不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備（S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯的重組大腸桿菌，所述重組 大腸桿菌是同時(shí)具有幾基還原酶基因（Carbonyl reductase from Synechocystis sp.PCC 6803，SrCR)和葡萄糖脫氫酶基因（Glucose dehydrogenase from Bacillus subtilis， ⑶H)的大腸桿菌。
[0009] 其中，羰基還原酶SsCR基因含有723bp堿基，其在Genbank中的收錄號(hào)為 CP003265(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/451779298 ? from = 1437173&to =1437895&sat = 4&sat_key = 105780430&report = fasta)，其基因序列如 SEQ ID NO: 1所示。由該基因編碼的羰基還原酶，包含240個(gè)氨基酸，其在Genbank中的收 錄號(hào)為 NP_441203(http://www.ncbi. nlm. nih. gov/protein/16330475 ? report = genbank&log$ = protalign&blast_rank = l&RID = 8AV63XPF01R)，其氨基酸序列如 SEQ ID NO :2 所示。
[0010] 葡萄糖脫氫酶⑶H基因含有783bp堿基，其在Genbank中的收錄號(hào)為 M12276(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/142954 ? from = 71&to = 853&sat = 4&sat_key = 42714303&report = fasta)，其基因序列如 SEQ ID N0:3 所不。由該基因編 碼的羰基還原酶，包含260個(gè)氨基酸，其在Genbank中的收錄號(hào)為AAA22463(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/142955 ? report = genbank&log$ = protalign&blast_rank =l&RID = 8CKY4132015)，其基因序列如 SEQ ID N0:4 所示。
[0011] 所述重組大腸桿菌能夠同時(shí)表達(dá)羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶。
[0012] 本發(fā)明首先分別從pET-28a-SrCR和pET-28a-GDH載體中克隆出帶有SD序列的基 因片段SD-SrCR和SD-GDH，構(gòu)建出雙酶耦合表達(dá)系統(tǒng)pET-28a-SrCR-GDH，然后將所述雙酶 耦合表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，制得一種可不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備（S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯的 重組大腸桿菌。
[0013] 本發(fā)明還提供一種如上所述的重組大腸桿菌在4-氯乙酰乙酸乙酯不對(duì)稱還原制 備（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明還提供一種制備（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法。
[0015] 該方法包括：采用如上所述的重組大腸桿菌，以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，并以 葡萄糖為輔助底物，以氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP)為輔因子，進(jìn)行不對(duì)稱還 原反應(yīng)將所述底物4-氯乙酰乙酸乙酯轉(zhuǎn)化成（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。
[0016] 所述方法中不需要額外添加輔酶。
[0017] 所述方法還包括向該反應(yīng)體系中引入大孔吸附樹(shù)脂以實(shí)現(xiàn)原位底物、產(chǎn)物移除， 從而減弱反應(yīng)體系中底物抑制和產(chǎn)物抑制。所述大孔吸附樹(shù)脂可以是HZ814、HZ816、XAD4、 XAD1180、XAD7HP中的一種，但是最優(yōu)選為HZ814,經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該樹(shù)脂的效果最好，得 到的底物轉(zhuǎn)化率最高。
[0018] 所述底物4-氯乙酰乙酸乙酯的初始反應(yīng)濃度為20mM~3000mM，葡萄糖的初始反 應(yīng)濃度為35mM~4500mM。
[0019] 優(yōu)選地，所述底物4-氯乙酰乙酸乙酯的初始反應(yīng)濃度為400mM~lOOOmM，葡萄糖 的初始反應(yīng)濃度為600mM~1500mM。
[0020] 所述不對(duì)稱還原反應(yīng)采用水相系統(tǒng)轉(zhuǎn)化法。雖然現(xiàn)有技術(shù)中兩相法和單水相催化 都比較普遍，相比較而言單水相催化避免了大量有機(jī)試劑對(duì)催化劑的毒害作用，有助于提 高反應(yīng)效率，而本發(fā)明通過(guò)加入樹(shù)脂可以有效地解決單水相反應(yīng)中產(chǎn)物/底物濃度過(guò)高導(dǎo) 致的產(chǎn)物/底物抑制原位移除產(chǎn)物抑制和底物抑制。
[0021] 所述重組大腸桿菌以凍干菌體形式提供。
[0022] 優(yōu)選地，所述重組大腸桿菌懸浮于pH 6. 5~7. 5的磷酸緩沖溶液中進(jìn)行所述不對(duì) 稱還原反應(yīng)。
[0023] 本發(fā)明人通過(guò)在微生物法生產(chǎn)（S)-4_氯-3-羥基丁酸乙酯領(lǐng)域中進(jìn)行大量的 研宄，通過(guò)基因組探礦技術(shù)從集胞藻細(xì)胞中獲得了一條能夠催化底物COBE的還原酶基因 (SrCR)，并結(jié)合從枯草芽孢桿菌中獲得的葡萄糖脫氫酶基因（GDH)，將這兩段基因構(gòu)建到 同一載體質(zhì)粒中，并成功在大腸桿菌中進(jìn)行了高活性表達(dá)，經(jīng)過(guò)發(fā)酵和催化反應(yīng)研宄，證 實(shí)了該羰基還原酶能夠應(yīng)用于高活性和高選擇性地催化COBE生成（S) -CHBE，其酶活高達(dá) 33. lU/mg，達(dá)到文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)最高水平。通過(guò)使用大孔吸附樹(shù)脂，特別是HZ814,原位移除底物、 產(chǎn)物抑制，使最終產(chǎn)物（S) -CHBE的積累量可達(dá)3000mM，最終底物轉(zhuǎn)化率高達(dá)100 %，產(chǎn)物光 學(xué)純度e. e%最尚可達(dá)99. 4%，相比現(xiàn)有技術(shù)均有了顯者的提尚。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1是本發(fā)明的重組共表達(dá)載體pET28a-SsCR-GDH的物理圖譜。
[0025] 圖2是電泳圖譜，其中，泳道1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2示出了本發(fā)明的純化 后羰基還原酶的SDS-PAGE電泳條帶。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0027] 實(shí)施例1 :重組大腸桿菌的構(gòu)建
[0028] 1、羰基還原酶基因的獲?。?br>[0029] 藍(lán)細(xì)菌 Synechocystis sp. PCC 6803 (購(gòu)于 Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria)，培養(yǎng)基 Zobell 2216E(g ? I/1):蛋白胨 5g，酵母膏 lg，磷酸高鐵 0? lg，陳 海水 1000mL，pH 7. 6。
[0030] 將藍(lán)細(xì)菌 Synechocystis sp. PCC 6803 接種于 4mL Zobell 2216E 液體培養(yǎng)基中 25°C至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用基因組DNA提取試劑盒（上海捷瑞公司細(xì)菌基因組提取試劑盒） 提取基因組。
[0031] 構(gòu)建表達(dá)載體所用的引物加設(shè)酶切位點(diǎn)，引物序列如下：
[0032] 上游引物（SrCR-F 含 Bam HI)為：AACGCGGATCCATGTTAAGTCTT GGITTGGAAG，下游引 物（SrCR-R含Hindlll)為：AACCCAAGCTTAGGTGTGGTGGGCCCCAITT，所有引物均由上海捷瑞公 司合成。
[0033] 東洋紡 K0D 酶 PCR 反應(yīng)體系為：H20 32. 5ul、緩沖液 5ul、2_ dNTP 5ul、 MgCl22. 5ul、模板2ul、20mM F/R引物lul、KOD酶lul。瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)條帶大小正確 后，使用天根公司膠回收純化試劑盒回收擴(kuò)增得到的基因。隨后，使用Fermentas公司內(nèi)切 酶BamHI和HindIII切割基因末端獲得有懸掛末端