一種耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶sod19及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種克隆自深海細(xì)菌枯草芽孢桿菌 (Bacillussp.SCSIO15121)的耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶SOD19及其編碼基因 和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD，EC1. 15. 1. 1)主要生理作用是清 除體內(nèi)氧自由基，氧自由基在生物體內(nèi)的過度積累會導(dǎo)致衰老、細(xì)胞凋亡等過程，因而，SOD 酶被廣泛應(yīng)用在生物醫(yī)藥、化妝品、食品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。例如，研宄表明服用SOD藥物能夠 預(yù)防和治療癌癥，SOD藥物對于食道癌、直腸癌和乳腺癌等均有較好療效，因此，SOD在生物 醫(yī)療領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用價值。
[0003] 再如，在化妝品中添加SOD的主要作用是利用SOD來清除自由基，人們在長期的強 光、缺氧等環(huán)境下能產(chǎn)生對皮膚造成損害的活性氧?；钚匝醪荒芗皶r清除會導(dǎo)致衰老，衰老 過程和SOD表達(dá)量的減少密切相關(guān)。另外，皮膚中的SOD表達(dá)量也會隨著年齡的增長而減 少，SOD可以通過皮膚吸收并解決諸多皮膚問題，因此SOD深受女性的喜愛。
[0004] 另外，SOD在食品中也有較大的應(yīng)用價值，一些SOD通過口服也是有效的，因此通 過食物補充SOD也是可行的。SOD酸奶、SOD啤酒、水果和大米等食品不斷被開發(fā)。
[0005] 隨著SOD應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，SOD的需求越來越大。開發(fā)高品質(zhì)的SOD酶，尤其是熱 溫度的S0D，就顯得十分迫切。比如食品加工過程大多涉及到加熱提取，滅菌等過程，常溫 SOD酶很難滿足應(yīng)用?，F(xiàn)階段SOD的來源主要有：第一，從動物或其組織中直接提??；第二， 從微生物或其它生物中提?。坏谌?，利用生物工程的方法發(fā)酵獲得。第一種方法獲得的SOD 存在艾滋病等血液病毒交叉感染的潛在危險，第二種方法受原材料制約，只有第三種方法 技術(shù)簡單、效率高、成本低，符合工業(yè)生產(chǎn)的需要。
[0006] 超氧化物歧化酶是一類金屬酶，需要結(jié)合金屬離子才能催化清除氧自由基的過 程，根據(jù)金屬離子輔基的不同，可以將SOD分為三大類：Cu/ZnSOD，F(xiàn)e或Mn-SOD以及 Ni-SOD。SOD酶穩(wěn)定性和酶活較高的多集中在SODA家族的Fe和Mn-SOD。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶S0D19及 其編碼基因。
[0008] 本發(fā)明的耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶S0D19,其特征在于，其氨基酸序列 如SEQIDNo. 2 所示。
[0009] 本發(fā)明的編碼耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶S0D19的基因，其特征在于， 編碼氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示的耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶S0D19。
[0010] 所述的編碼耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶S0D19的基因，優(yōu)選，其核苷酸 序列如SEQIDNo. 1所示。
[0011] 本發(fā)明的第二個目的是提供核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示的基因在編碼耐高溫 耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶S0D19中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種表達(dá)載體，其特征在于，含有上述編碼耐高溫耐 有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶S0D19的基因。
[0013] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種含有上述表達(dá)載體的微生物。
[0014] 本發(fā)明的第四個目的是提供耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶S0D19的誘導(dǎo) 表達(dá)方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0015] 將轉(zhuǎn)有編碼耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶S0D19基因的微生物在培養(yǎng)基 中培養(yǎng)至0D600為0. 5-0. 6,加IPTG至濃度為0. 2mM，再加]^(：12至濃度為0.ImM，18°C培養(yǎng) 16個小時，即可高效誘導(dǎo)表達(dá)耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶S0D19。
[0016] 本發(fā)明的第五個目的是提供耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶S0D19在制備 生物醫(yī)藥、化妝品和食品中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶基因sodl9來自深海樣品中篩選 得到的一株枯草芽孢桿菌（Bacillussp.SCSI015121)。本發(fā)明對枯草芽孢桿菌（Bacillus SP.SCSI015121)進(jìn)行基因組測序和生物信息學(xué)分析，確定了超氧化物歧化酶基因S〇dl9邊 界，并設(shè)計引物，在引物5'端加上保護(hù)堿基和酶切位點，其中上游引物加入EcoRI位點，下 游加入Xhol酶切位點。提取純化提取枯草芽孢桿菌（BacillusSp.SCSI015121)的總DNA， 使用高保真的DNA聚合酶pfu進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得超氧化物歧化酶基因sodl9,其核苷酸序 列如SEQIDNo. 1所示，從起始密碼子到終止密碼子全長為609p，編碼202個氨基酸。
[0018] 擴(kuò)增得到的超氧化物歧化酶基因sodl9用EcoRI和Xhol酶切，經(jīng)核酸純化回收試 劑盒（Magen，HipureGelPureDNAMicroKit)回收后與pET_28a(+)連接獲得重組表達(dá)載 體，將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)表達(dá)重組產(chǎn)物超氧化物歧化酶S0D19,結(jié)合 金屬酶的特點，本發(fā)明從誘導(dǎo)劑的濃度，蛋白表達(dá)溫度以及Mn2+添加的時間和濃度這幾個 方面對誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行了優(yōu)化，并對重組產(chǎn)物超氧化物歧化酶S0D19進(jìn)行酶活測定、金屬類 型測定及酶學(xué)特性鑒定，結(jié)果表明本發(fā)明的超氧化物歧化酶S0D19酶活為3215. 6±143. 2U mg'符合Mn-SOD特征，最適pH為8. 0,最適反應(yīng)溫度為60°C左右，具有較高的熱穩(wěn)定性， 70°〇左右酶活基本保持不變，801：處理111依然有70%的酶活存在，1001：處理111依然有 50%的酶活，另外對有機(jī)溶劑也有較好的耐受性。
[0019] 綜上，本發(fā)明的超氧化物歧化酶S0D19是一種耐高溫、耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧 化酶，。
[0020] 本發(fā)明提供了一種耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶S0D19及其編碼基因，該 超氧化物歧化酶S0D19具有較好的熱穩(wěn)定性，在食品、生物醫(yī)藥和化妝品制備中具有非常 大的應(yīng)用價值。
[0021] 本發(fā)明的枯草芽孢桿菌（Bacillussp.SCSIO15121)為發(fā)明人所在實驗室從印度 洋深海海泥中分離得到并保藏，本申請人保證自申請日起20年內(nèi)向公眾提供該枯草芽孢 桿菌（Bacillussp.SCSIO15121)。
【附圖說明】：
[0022] 圖1是Mn-SOD基因的蛋白表達(dá)純化結(jié)果，其中，1 :BL21(DE3)，pET28a-SOD19 ;2 : BL21 (DE3)，pET-28a-S0D19 上清；3 ~8 分別為：20mM咪唑，50mM咪唑，lOOmM咪唑，200mM咪 唑，300mM咪唑，400mM咪唑洗脫液；
[0023] 圖2是不同pH對超氧化物歧化酶SOD19活力的影響；
[0024] 圖3是超氧化物歧化酶S0D19的最適反應(yīng)溫度；
[0025] 圖4是不同溫度處理lh后超氧化物歧化酶S0D19的活性情況；
[0026] 圖5是抑制劑對超氧化物歧化酶S0D19活性的影響，其中，1 :S0D19未處理；2: CH3C1-C2H50H(3 : 5,V/V)處理后的S0D19 活性；3 :10mMH202處理后的S0D19 活性。
【具體實施方式】：
[0027] 以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0028] 實施例1 :
[0029] 1、超氧化物歧化酶基因sodl9引物設(shè)計及開放閱讀框邊界確定
[0030] 將實驗室保存的枯草芽孢桿菌（Bacillussp.SCSI015121)在LB固體培養(yǎng)基劃線 培養(yǎng)。每1LLB固體培養(yǎng)基配方為：NaCl10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，瓊脂15g。
[0031] 挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基中，200rpm，37°C培養(yǎng)。取3mL菌液離心，收集菌體， 用DNA提取試劑盒（GeneJetGenomicDNAPurtificationKit，購自Thermo公司）提取 總DNA，經(jīng)16SrRNA驗證無誤后，交至上海美吉生物科技有限公司測序。
[0032] 對基因組進(jìn)行注釋，分析其中的sod基因，確定了其中超氧化物歧化酶基因 S〇dl9,設(shè)計引物如下（下劃線表示酶切位點）：
[0033]正向引物：5 ' -GGTGAATTCATGGCTTACAAACTTCCAG-3 '
[0034]反向引物：5 ' -CTGCTCGAGTTATTTTGCTTCGCTGTAAAG-3 '。
[0035] 2、超氧化物歧化酶基因sodl9的克隆及載體構(gòu)建
[0036] 2. 1PCR擴(kuò)增
[0037] 將引物序列送至上海生物工程有限公司進(jìn)行合成引物，合成的引物使用TE稀釋 到10yM，建立如下反應(yīng)體系：
[0038] 表1.PCR反應(yīng)體系
[0039]
【主權(quán)項】
1. 一種耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶S0D19,其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2 所示。
2. -種編碼權(quán)利要求1所述的耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶S0D19的基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶S0D19的基因，其 特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
4. 權(quán)利要求3所述的基因在編碼權(quán)利要求1所述的耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化 酶S0D19中的應(yīng)用。
5. -種表達(dá)載體，其特征在于，含有權(quán)利要求2或3所述的編碼耐高溫耐有機(jī)溶劑的超 氧化物歧化酶S0D19的基因。
6. -種含有權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體的微生物。
7. -種權(quán)利要求1所述的耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶S0D19的誘導(dǎo)表達(dá)方 法，其特征在于，包括以下步驟： 將轉(zhuǎn)有編碼耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶S0D19基因的微生物在培養(yǎng)基中培 養(yǎng)至0D600為0. 5左右，加 IPTG至濃度為0. 2mM，再加血(：12至濃度為0.1 mM，18°C培養(yǎng)16 個小時，即可高效誘導(dǎo)表達(dá)耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶S0D19。
8. 權(quán)利要求1所述的耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶S0D19在制備生物醫(yī)藥、化 妝品和食品中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶SOD19及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明的耐高溫耐有機(jī)溶劑的超氧化物歧化酶SOD19，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，編碼該超氧化物歧化酶SOD19的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明的超氧化物歧化酶SOD19具有較好的穩(wěn)定性，100℃處理1h還有約50％的酶活。該超氧化物歧化酶在食品、生物醫(yī)藥和化妝品中具有非常大應(yīng)用價值。
【IPC分類】C12N15-70, A23L1-30, C12N15-53, C12R1-19, C12N9-02, A61P35-00, A61K8-66, A61Q19-08, C12N1-21
【公開號】CN104651327
【申請?zhí)枴緾N201510083717
【發(fā)明人】胡云峰, 鄧盾, 張云, 孫愛君, 梁甲元
【申請人】中國科學(xué)院南海海洋研究所
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年2月13日