從玉米中分離的組織特異性啟動子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 發(fā)明涉及一種從植物中分離的啟動子，尤其涉及從玉米（Zeamays)中分離的組 織特異性啟動子，本發(fā)明還涉及含有該組織特異性啟動子的重組植物表達載體以及宿主細 胞，本發(fā)明進一步涉及它們在提高作物種子品質(zhì)、改良作物性狀、培育植物新品種等方面的 應(yīng)用，屬于植物組織特異性啟動子的分離及其應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 啟動子是RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合的DNA序列，是重要的順式作用元件，一般 位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游區(qū)。高等植物基因調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平進行，啟動子控制著基因表 達的起始時間和表達程度，同時對所使用的RNA聚合酶類型也起著決定性作用，所以啟動 子是理解基因表達模式和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的關(guān)鍵，是植物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心。
[0003] 根據(jù)啟動子的轉(zhuǎn)錄模式及功能，可將其分為三類：組成型啟動子、組織或器官特 異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。目前，在植物基因工程中使用的大多數(shù)為組成型啟動子，使 外源目的基因在植物各組織部位高水平表達，但是組成型啟動子也有諸多缺點，例如，不 能從時間和空間上有效地調(diào)控目的基因的表達，過度消耗細胞內(nèi)的物質(zhì)和能量（Gittins JR,PellnyTK,HilesER,RosaC,BiricoltiS,etal. (2000)Transgeneexpression drivenbyheterologousribulose-l, 5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase small-subunitgenepromotersinthevegetativetissuesofapple(Maluspumila mill.).Planta210:232-240.);大量異源蛋白或代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)積累，打破植物的 代謝平衡，不利于植物生長（RobinsonDJ(1996)Environmentalriskassessmentof releasesoftransgenicplantscontainingvirus-derivedinserts.Transgenic research5:359-362.);容易引起基因沉默或共抑制現(xiàn)象（KumpatlaSP，Chandrasekharan MB,IyerLM,GuofuL,HallTC(1998)Genomeintruderscanningandmodulationsystems andtransgenesilencing.TrendsinPlantScience3:97-104；MetteMF,Aufsatz ff,vanderffindenJ,MatzkeMA,MatzkeAJ(2000)Transcriptionalsilencingand promotermethylationtriggeredbydouble-strandedRNA.EMBOJ19:5194-5201.)。因 此，科學(xué)家們不斷尋找更為有效的組織或器官特異性啟動子來代替組成型啟動子，以期更 精確的調(diào)控外源基因的表達。
[0004] 組織或器官特異性啟動子調(diào)控下的基因轉(zhuǎn)錄過程一般只發(fā)生在某些特定的組織 或者器官中。組織或器官特異性表達啟動子可以更加經(jīng)濟有效的調(diào)控外源基因的表達，特 異地在特定需要的部位發(fā)揮作用，這樣不僅可以提高外源基因的表達豐度，而且將生物能 耗降到最低，從而不影響植株的正常生長。
[0005] 玉米（Zeamays)是中國最大的糧食作物，也是重要的轉(zhuǎn)基因作物。玉米組織特異 性啟動子可分為根、莖、葉、花、胚、胚乳、果實、木質(zhì)部、綠色組織等組織或器官特異性啟動 子，每一類型的組織特異性啟動子都具有一些特殊的功能元件。從玉米中分離獲得組織特 異性啟動子，可以利用該組織特異性啟動子驅(qū)動目的基因在植物組織中進行特異性的高效 表達，這對玉米進行分子改良或生產(chǎn)具有特殊用途的新玉米品種等方面有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的之一是提供從玉米（Zeamays)中分離的組織特異性啟動子。
[0007] 本發(fā)明目的之二是提供含有上述組織特異性啟動子的重組表達載體以及含有該 重組表達載體的宿主細胞。
[0008] 本發(fā)明目的之三是將所述的組織特異性啟動子以及含有該組織特異性啟動子的 重組表達載體應(yīng)用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物、改良農(nóng)作物種子性狀、培育具有優(yōu)良性狀的植物新 品種等。
[0009] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了一種從玉米（Zeamays)中分離的組織特異性 啟動子，其多核苷酸序列為（a)、（b)、（c)或（d)所示：
[0010] (a)、SEQIDNO. 1所示的多核苷酸序列；或
[0011] (b)、與SEQIDNO. 1的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該多 核苷酸仍具有組織特異性啟動子的功能或活性；或
[0012] (C)、與SEQ ID NO. 1的多核苷酸序列至少有60%以上同源性的多核苷酸序列，且 該多核苷酸具有組織特異性啟動子的功能或活性；優(yōu)選的，與SEQ ID NO. 1的多核苷酸序列 至少有80%以上同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸具有組織特異性啟動子的功能或活 性；更優(yōu)選的，與SEQ ID NO. 1的多核苷酸序列至少有90%以上同源性的多核苷酸序列，且 該多核苷酸具有組織特異性啟動子的功能或活性；最優(yōu)選的，與SEQ ID NO. 1的多核苷酸序 列至少有90%以上同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸具有組織特異性啟動子的功能或 活性；或
[0013] (d)、在SEQIDNO. 1的基礎(chǔ)上進行一個或多個堿基的缺失、取代或插入獲得的多 核苷酸變體，該多核苷酸變體包含SEQIDNO. 2所示序列，且該多核苷酸變體仍具有組織特 異性啟動子的功能或活性。
[0014] 本發(fā)明將SEQIDNO. 1所示的多核苷酸序列從5'端逐漸刪除部分序列獲得的SEQ IDNO. 2所示的181bp的啟動子缺失片段（為-181-+1之間的片段）。
[0015] 本發(fā)明將SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示的多核苷酸與⑶S基因可操作的連接， 分別構(gòu)建得到重組植物表達載體；以玉米為受體材料，采用基因槍轉(zhuǎn)化的瞬時表達體系對 啟動子進行功能驗證，試驗結(jié)果表明SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2驅(qū)動的⑶S基因僅在玉 米種子的胚中進行特異性表達，在玉米種子胚乳、根、莖、葉等其它組織部位里沒有GUS表 達活性；試驗結(jié)果證實，本發(fā)明從玉米中所分離的SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示的核苷 酸序列為組織特異性啟動子。
[0016] 本發(fā)明進一步將SEQIDNO. 1所示的全長啟動子從5'端開始逐漸刪除得到四 個截短的啟動子片段P855Q2-4(SEQIDN0.3)、P855(i2_q(SEQIDN0.4)、P855Q2_2(SEQIDN0.5)、 卩855(12_6(3￡〇10勵.6);將截短后的四個序列分別連接到帶有報告基因的表達載體上構(gòu)建 得到穩(wěn)定表達載體P85502-4G3、p85502-0G3、p85502-2G3和p85502-6G3 ;將穩(wěn)定表達載體 P85502-0G3和穩(wěn)定表達載體p85502-2G3采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法分別轉(zhuǎn)化了玉米材料，將 穩(wěn)定表達載體P85502-4G3和穩(wěn)定表達載體p85502-6G3按照農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法分別轉(zhuǎn)化了 擬南芥，得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株；功能驗證結(jié)果表明，啟動子缺失片段P85k仍具有 在胚組織中啟動報告基因表達的功能，啟動子缺失片段P855(I2KI是一個啟動子活性降低的在 正常生理條件下的胚組織特異性啟動子，但在機械損傷誘導(dǎo)下在葉鞘組織表現(xiàn)出誘導(dǎo)表達 的特性。從轉(zhuǎn)基因擬南芥各組織染色結(jié)果可以看出，更短的p855(12缺失片段仍具有啟動子活 性，只是匕551 4與P85516比較而言仍保持有誘導(dǎo)表達的特性。
[0017] 在轉(zhuǎn)基因玉米/擬南芥中驅(qū)動報告基因⑶S表達的結(jié)果可以看出，這四個啟動子 缺失片段仍具有啟動子的活性，但其啟動強度和組織特異性均發(fā)生一些改變。因此，本發(fā)明 提供了一種SEQID NO.2所示的組織特異啟動子的缺失片段，其多核苷酸序列為（a)、（b)、 (c)或（d)所示：
[0018] (a)、SEQ ID NO. 2所示的多核苷酸序列；或
[0019](b)、與SEQ ID NO. 2的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該多 核苷酸仍具有啟動子的功能或活性；或
[0020] (C)、與SEQIDNO. 2的多核苷酸序列至少有60%以上同源性的多核苷酸序列， 且該多核苷酸具有啟動子的功能或活性；優(yōu)選的，與SEQIDNO. 2的多核苷酸序列至少有 80%以上同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸具有啟動子的功能或活性；更優(yōu)選的，與 SEQIDNO. 2的多核苷酸序列至少有90%以上同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸具有 啟動子的功能