環(huán)脂肽抗生素羅克霉素生物合成相關(guān)的基因簇的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于微生物基因資源和基因工程領(lǐng)域，具體涉及具有廣譜抗菌活性，特別 是抗病毒活性的環(huán)脂肽抗生素羅克霉素（locillomycin)的生物合成、分析、功能研究及應(yīng) 用。 技術(shù)背景：
[0002] 脂肽類抗生素是枯草芽孢桿菌及其相近物種通過(guò)非核糖體合成途徑合成的一類 由親水性環(huán)狀短肽頭部和長(zhǎng)鏈?zhǔn)杷灾舅嵛膊拷M成的次生代謝產(chǎn)物，具有抗菌活性和溶 血性能，在醫(yī)藥、農(nóng)藥和工業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。脂肽類抗生素根據(jù)其合成的基因簇和 化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異可分為表面活性素（Surfactin)、伊枯草素（Iturin)和泛革素（Fengycin) 三大家簇。
[0003] 表面活性素家簇結(jié)構(gòu)的共同特點(diǎn)是由7個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈通過(guò)酯鍵與含有 13~15個(gè)碳原子羥基脂肪酸交聯(lián)形成內(nèi)酯環(huán)狀結(jié)構(gòu)的極性化合物。表面活性素通過(guò) 作用于細(xì)胞膜的磷脂雙分子層而表現(xiàn)出較強(qiáng)溶血活性、抑制細(xì)菌和病毒的活性。該家簇主 要包括枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的表面活性素，短小芽孢桿菌產(chǎn)生的表面活性劑（Pumilacidin)， 地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的地衣芽孢桿菌素（lichenysin)。由于表面活性素7個(gè)氨基酸殘基的變 異性較大，表現(xiàn)出很強(qiáng)的多樣性。
[0004] 伊枯草素家簇結(jié)構(gòu)的共同特點(diǎn)是由7個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈與含有14~ 17 3 -氨基脂肪酸鏈相連形成的化合物。伊枯草素也具有較強(qiáng)的溶血活性，主要是通過(guò)影響 真菌細(xì)胞膜的表面張力，導(dǎo)致微孔的形成、促使電解質(zhì)及其他重要離子的滲漏而表現(xiàn)出強(qiáng) 的抗真菌活性。然而，伊枯草素對(duì)細(xì)菌和病毒的抑制活性較弱。伊枯草素家簇由枯草芽孢 桿菌及其近源菌種合成分泌，主要包括9個(gè)異構(gòu)體IturinA、C、D、E、BacillomycinD、F、L、 Lc和Mycosubtilin。
[0005] 泛革素家簇結(jié)構(gòu)的共同特點(diǎn)是由10個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈通過(guò)酯鍵與含有14~ 18個(gè)羥基飽和或非飽和的脂肪酸交聯(lián)形成內(nèi)酯環(huán)。泛革素的溶血作用沒(méi)有表面活 性素和伊枯草素強(qiáng)烈，但表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗真菌活性和弱的抗細(xì)菌和病毒活性。泛革素也 主要是由枯草芽孢桿菌及其相近菌種合成分泌，主要包括4中異構(gòu)體FengycinA、B和 PlipastatinA、B〇
[0006] 脂肽類化合物合成酶系NRPSs是目前所發(fā)現(xiàn)的最大的酶系之一，由多個(gè)模塊 (Module)按一定的空間順序排列而成，一個(gè)典型的模塊大約有1000個(gè)氨基酸組成，主要負(fù) 責(zé)一次底物縮合反應(yīng)，負(fù)責(zé)將一個(gè)氨基酸整合到延伸的肽骨架上。每個(gè)模塊一般都含有氨 基酸腺苷醜化（aminoacidadenylationdomain，A)、膚醜載體蛋白（peptidylcarrier proteindoamin，PCP)、和縮合（condensationdomain，C)三個(gè)基本結(jié)構(gòu)域。上述基本結(jié)構(gòu) 域?qū)被嵴系诫墓羌艿木唧w過(guò)程是：1)A結(jié)構(gòu)域從底物池中選擇結(jié)合特定的氨基酸， 在ATP的作用下將底物活化；2)活化的底物，氨酰-AMP與PCP結(jié)構(gòu)域上的輔因子磷酸泛酰 巰基乙胺（4' _phosphopantetheine，Ppant)的巰基結(jié)合，形成氨酰-S-載體復(fù)合物；3)分 別攜帶有氨?；碗孽；妮d體與C結(jié)構(gòu)域上的特定區(qū)域結(jié)合，形成新肽鍵，產(chǎn)生延長(zhǎng)了 一個(gè)氨基酸的新的肽鍵-S-載體復(fù)合物和游離的載體。在上述基本結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上，有些 模塊還存在一些修飾結(jié)構(gòu)域，通常與基本結(jié)構(gòu)域毗鄰，對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行進(jìn)一步修飾。如， 差向異構(gòu)化結(jié)構(gòu)域（Epimerization，E)催化L-型的氨基酸轉(zhuǎn)化為D-型氨基酸，甲基轉(zhuǎn)移 酶結(jié)構(gòu)域（methyltransferasedomain，M)。在合成酶系NRPSs的最后一個(gè)模塊包含一個(gè) 硫酯酶結(jié)構(gòu)域（Thioesterasedomain，TE)，該結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)脂肽類化合物的環(huán)化和從復(fù)合酶 上的釋放。脂肽類的化合物的肽序列和催化模塊的排列之間存在線性關(guān)系，即模塊的數(shù)量、 種類和排列的空間順序決定了相應(yīng)脂肽類化合物肽序列的氨基酸殘個(gè)數(shù)、種類和順序。這 種具有共線性結(jié)構(gòu)域的NRPSs成為線性NRPSs(A型）。目前也發(fā)現(xiàn)一些偏離經(jīng)典的共線性 結(jié)構(gòu)體系的NRPSs，如重復(fù)性NRPSs(B型）和非線性NRPSs(C型）。
[0007] 上述脂肽類化合物大多數(shù)在幾十年前就被分離、鑒定和申請(qǐng)了專利。隨著基因工 程技術(shù)興起，這些脂肽類化合物的合成基因簇也被陸續(xù)克隆報(bào)道和申請(qǐng)了專利。在伊枯草 素家簇，1952年美國(guó)科學(xué)家申請(qǐng)了Mycosubtilin的專利，專利號(hào)為2602767 ;2001年日本 科學(xué)家申請(qǐng)了IturinA基因簇的專利，專利號(hào)為P2001-231561A;2004年德國(guó)科學(xué)家申請(qǐng) 了BacillomycinD基因簇的專利，專利號(hào)為W0 / 2004 / 111240A2;在2010年本研究團(tuán) 隊(duì)也首次克隆報(bào)道了脂肽類抗生素BacillomycinL的結(jié)構(gòu)基因簇。目前發(fā)現(xiàn)報(bào)道的脂肽 類化合物的NRPSs都是共線性關(guān)系，未見重復(fù)性和非線性關(guān)系的報(bào)道。
[0008] 脂肽類化合物的一個(gè)重要特點(diǎn)是由脂肪酸和肽組成的雜合抗生素，催化脂肪酸和 肽連接的酶叫做聚酮合成酶（polyketidesynthases,PKSs)。盡管不同來(lái)源的PKSs都具 有比較高的同源性，但不同的PKSs作用的底物都有較強(qiáng)的底物專一性，底物結(jié)構(gòu)的變化會(huì) 給這些PKSs催化的活性造成很大影響。脂肽類化合物的另一個(gè)重要特點(diǎn)是其肽段含有非 蛋白質(zhì)性質(zhì)的氨基酸。這些非蛋白質(zhì)性質(zhì)氨基酸是經(jīng)過(guò)與腺苷?；Y(jié)構(gòu)域和毗鄰的后修飾 結(jié)構(gòu)域，包括：差向異構(gòu)、羥基化、羧基化和環(huán)氧化等結(jié)構(gòu)域催化得來(lái)。大多數(shù)情況下這些后 修飾步驟導(dǎo)致產(chǎn)生藥效團(tuán)特性。對(duì)于聚酮合成酶、腺苷?；Y(jié)構(gòu)域和后修飾結(jié)構(gòu)域?qū)τ诘?物的選擇性也使其成為組合生物合成的引用注目的工具。
[0009] -直以來(lái)，提高菌株次生抗菌代謝化合物是工業(yè)生產(chǎn)抗菌化合物致力解決的優(yōu)先 問(wèn)題。然而傳統(tǒng)的通過(guò)改善發(fā)酵條件，或者通過(guò)化學(xué)誘變篩選產(chǎn)量提高的抗菌化合物產(chǎn)生 菌株越來(lái)越受到限制，并且很容易達(dá)到飽和。脂肽類化合物的生產(chǎn)和應(yīng)用也面臨著同樣的 問(wèn)題。隨著生物技術(shù)的發(fā)展特別是基因工程的飛速發(fā)展，提供了通過(guò)改造抗菌化合物產(chǎn)生 菌株中相關(guān)基因而大幅度提高抗菌化合物產(chǎn)量的途徑。這其中增加正調(diào)控基因拷貝數(shù)或打 斷負(fù)調(diào)控基因是最重要的途徑之一。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0010] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新環(huán)脂肽抗生素羅克霉素生物 合成基因簇。本發(fā)明提供了羅克霉素生物合成相關(guān)的所有基因和蛋白信息，為生物合成羅 克霉素和遺傳改造提供了基礎(chǔ)；本發(fā)明的羅克霉素生物合成基因簇及其蛋白可以廣泛用于 農(nóng)業(yè)、工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域。
[0011] 本發(fā)明通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0012] 本發(fā)明涉及一種由枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis916產(chǎn)生的具有廣譜抗菌活 性，特別是抗病毒活性的環(huán)脂肽抗生素-羅克霉素（locillomycin)的生物合成基因簇，其 序列如SEQIDNO:1所示。
[0013] 所述羅克霉素生物合成基因簇包含10個(gè)基因：
[0014]結(jié)構(gòu)基因 4 個(gè)：LocD、LocA、LocB和LocC;其中：
[0015] 所述基因LocD，位于SEQIDNO:1的第7565~11446位，
[0016] 所述基因LocA，位于 SEQIDN0 :1 的第 11667 ~18644 位，
[0017] 所述基因LocB，位于 SEQIDN0 :1 的第 18726 ~30332 位，
[0018] 所述基因LocC，位于 SEQIDN0 :1 的第 30402 ~36782 位；
[0019]轉(zhuǎn)運(yùn)基因 4 個(gè)：orf1、orf5、orf6 和orf7;其中：
[0020] 所述基因orf1，位于SEQIDNO:1的第5675~6550位，
[0021] 所述基因 orf5,位于 SEQIDN0 :1 的第 39787 ~40551 位，
[0022] 所述基因 orf6,位于 SEQIDN0 :1 的第 40538 ~42446 位，
[0023] 所述基因orf7,位于 SEQID N0 :1 的第 42518 ~45550 位；
[0024] 調(diào)芐基因2個(gè)：orf3和orf4;其中：
[0025] 所述基因orf3,位于 SEQID N0 :1 的第 36883 ~37566 位，
[0026] 所述基因orf4,位于 SEQID N0 :1 的第 37563 ~38585 位。
[0027] 所述4個(gè)結(jié)構(gòu)基因編碼的蛋白具體為：
[0028] 所述基因LocD編碼的蛋白序列如SEQID N0 :4所示，該蛋白為含有聚酮化合物合 成酶模塊的多功能復(fù)合酶，命名為羅克霉素合成酶D;
[0029] 所述基因LocA編碼的蛋白序列如SEQID N0:5所示，該蛋白為含有肽鏈延伸模塊 的多功能復(fù)合酶，命名為羅克霉素合成酶A;
[0030] 所述基因LocB編碼的蛋白序列如SEQIDNO:6所不，該蛋白為該蛋白為含有膚鏈 延伸模塊的多功能復(fù)合酶，命名為羅克霉素合成酶B;
[0031] 所述基因LocC編碼的蛋白序列如SEQIDN0 :7所不，該蛋白為該蛋白為含有膚鏈 延伸模塊和肽鏈環(huán)化模塊的多功能復(fù)合酶，命名為羅克霉素合成酶C;
[0032] 所述4個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)基因編碼的蛋白具體為：
[0033] 所述基因orfl編碼的蛋白序列如SEQIDN0:3所示，該蛋白為含有ATP結(jié)合結(jié)構(gòu) 域的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，命名為potA;
[0034] 所述基因orf5編碼的蛋白序列如SEQIDNO:10所示，該蛋白為含有ATP結(jié)合結(jié) 構(gòu)域的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，命名為potB;
[0035] 所述基因orf6編碼的蛋白序列如SEQIDNO