高粱γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶基因SbGABA-Ts及其在逆境脅迫響應中的功能的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及高粱Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（隸屬于乙酰鳥 氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AAT_I)超家族成員之一）編碼基因SbGABA-Ts，該基因與植物響應逆境脅迫 相關(guān)。本發(fā)明包含兩個亞型基因的克隆、原核表達純化、酶活鑒定、亞細胞定位及轉(zhuǎn)錄分析 等相關(guān)載體構(gòu)建及分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著生態(tài)環(huán)境的日益惡化，土壤干旱和鹽堿化程度日漸嚴重，已經(jīng)成為影響作物 高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要限制因子，因此提高作物的抗旱、耐鹽堿性是目前亟待解決的重要課題之 一。應用現(xiàn)代生物技術(shù)，挖掘抗逆基因資源、培育耐逆品種，是提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)最為經(jīng) 濟、有效的方法，也是我國糧食生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的重要舉措。
[0003] 高粱（Sorghumbicolor(L. )Moench)是全球第五大禾谷類作物，是一種重要的 糧食、飼料、能源等多功能C4作物，光合作用效率高，生物產(chǎn)量大，同時高粱抗旱性強、耐 鹽堿、產(chǎn)量高、適應性廣，適合我國中低產(chǎn)田開發(fā)利用。高粱基因組相對較小（730Mb)， 遺傳多樣性豐富，被認為是禾本科類作物基因組結(jié)構(gòu)、功能和進化研宄的重要模式基 因組之一（Calvin~〇M,MessingJ. (2011)Sweetsorghumasamodelsystemfor bioenergycrops.CurrentOpinioninBiotechnology, 23:1-7.)。隨著高粱基因組測 序完成（PatersonAH,BowersJE,BruggmannR,etal. (2009)TheSorghumbicolor genomeandthediversificationofgrasses.Nature, 457:551-556；MaceES,TaiS H,GildingEK,etal. (2013)Whole-genomesequencingrevealsuntappedgenetic potentialinAfrica'sindigenouscerealcropsorghum.NatureCommunications ，4:2320|D0I:10. 1038/nco_s3320.)，覆蓋高粱全基因組的高密度遺傳連鎖圖譜構(gòu)建也 日趨完善，基因功能鑒定以及遺傳轉(zhuǎn)化（KumarT,HoweA,SatoS，etal.(2013)Sorghum transformation:Overviewandutility.PlantGeneticsandGenomics:Cropsand Models，11:205-221.)的研宄亦取得了長足的進展。這對于高粱抗逆品種資源開發(fā)利用、抗 性機制的研宄、重要性狀基因的克隆、分子標記輔助選擇育種奠定了基礎(chǔ)。
[0004] y-氨基丁酸（y-aminobutyricacid，GABA)是在生物體內(nèi)廣泛存在的一種四 碳非蛋白質(zhì)氨基酸，其合成與代謝是通過TCA循環(huán)的一個旁路即GABA旁路進行的。已 有的研宄表明逆境脅迫下GABA代謝途徑在植物體內(nèi)碳氮源代謝、蛋白質(zhì)降解調(diào)控、激素 合成、活性氧形成、多胺代謝、信號傳遞以及與其它代謝機制互作，增強植物抗逆性等方 面發(fā)揮重要的作用（ShelpBJ，BozzoGG，TrobacherCP，etal. (2012a)Strategies andtoolsforstudyingthemetabolismandfunctionofy-aminobutyratein plants.I.Pathwaystructure.Botany, 90:651-668；ShelpBJ,BozzoGG,ZareiA,et al. (2012b)Strategiesandtoolsforstudyingthemetabolismandfunction ofy-aminobutyrateinplants.II.Integratedanalysis.Botany, 90:781-793.)，但抗逆 分子機制目前還不清楚。在擬南芥和煙草等作物中研宄證實GABA積累和代謝在鹽脅迫下 會被特異性地激活（RenaultH，RousselV，E1AmraniA，etal. (2010)TheArabidopsis pop2_lmutantrevealstheinvolvementofGABAtransaminaseinsaltstress tolerance.BMCPlantBiol. , 1:10-20；ZhangJ,ZhangY,DuY,etal. (2011)Dynamic metabonomicresponsesoftobacco(Nicotianatabacum)plantstosaltstress.J ProteomeRes.，10(4) : 1904-1914.)，其中y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（GABA-T)在鹽脅迫中響應 起關(guān)鍵性的作用，表明GABA代謝途徑與植物耐鹽性密切相關(guān)。但從該途徑研究高粱抗逆機 制目前還是個空白。
[0005] 由于GABA合成與代謝途徑簡單，遺傳操作簡便，在植物生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導、 抗逆性等方面發(fā)揮著重要的生物學作用（KonnoK，HirayamaC，YasuiH，etal. (2010) GABA,-alanineandglycineinthedigestivejuiceofprivet-specialist insects:convergentadaptivetraitsagainstplantiridoids.JChem Ecol.,36 (9):983-991；SuliemanS,SchulzeJ. (2010)Phloem-derivedy-aminobutyric acid(GABA)isinvolvedinupregulatingnoduleN2fixationefficiencyinthe modellegumeMedicagotruncatulapce.Plant,CellandEnvironment，33:2162-2172 ; FaitA，NesiAN,AngeloviciR，etal. (2011)Targetedenhancementofglutamate toy-aminobutyrateconversioninArabidopsisseedsaffectsC_Nbalance andstoragereservesinadevelopment-dependentmanner.PlantPhysiology Preview，157 (3) : 1026-1042.)，因此有關(guān)GABA代謝旁路的抗逆作用機制成為當前研究的 一個熱點和難點。
[0006] 已有的研宄表明GABA的功能主要與植物對逆境的應激反應有關(guān)，逆境脅迫會 導致植物體內(nèi)大量積累GABA(RenaultH,RousselV，ElAmraniA,etal. (2010)The Arabidopsispop2~lmutantrevealstheinvolvementofGABAtransaminasein saltstresstolerance.BMCPlantBiol.,1:10-20；RenaultH,AmraniAE，Palanivelu R，etal. (2011)GABAaccumulationcausescellelongationdefectsandadecrease inexpressionofgenesencodingsecretedandcellwall-relatedproteins inArabidopsisthaliana.PlantCellPhysiol.，52(5):894_908)d有關(guān)逆境脅迫 下植物中GABA能夠快速大量積累的現(xiàn)象存在幾種解釋，其中一種解釋是由于逆境脅 迫對gad基因表達、GAD酶活性、及GABA的合成產(chǎn)生影響，而GABA代謝和含量的變化 可能與植物體中的碳/氮源平衡有關(guān)（ZhangJ，ZhangY，DuY，etal.(2011)Dynamic metabonomicresponsesoftobacco(Nicotianatabacum)plantstosaltstress. JProteomeRes.，10(4) : 1904-1914.)。另外一種解釋是GABA的產(chǎn)生可能與腐胺降解 途徑有關(guān)（DittamiSM，GravotA，RenaultD，etal. (2011)Integrativeanalysisof metaboliteandtranscriptabundanceduringtheshort-termresponsetosaline andoxidativestressinthebrownalgaEctocarpussiliculosus.PlantCell Environ.，34(4) : 629-642.)，說明GABA的積累與可能多胺氧化降解有關(guān)，在植物抗逆生理 中發(fā)揮作用。
[0007] GABA在植物受到逆境脅迫時能夠快速積累已經(jīng)得到了很好的證實。然而，GABA及 其代謝途徑在不同逆境脅迫響應中的作用和特異性目前尚不清楚。以擬南芥作為模式作 物，經(jīng)過十幾年的研宄，通過對GABA代謝途徑酶學組成、功能及其作用域的解析，初步建立 了植物中GABA代謝途徑的區(qū)室化模型（見圖1)。GABA代謝途徑包括位于質(zhì)膜的GABA轉(zhuǎn) 運體、線粒體GABA透性酶（GABP)、胞質(zhì)Ca2+/鈣調(diào)蛋白和pH調(diào)控的谷氨酸脫羧酶（GAD)、 具有丙酮酸和乙醛酸底物活性調(diào)控的線粒體GABA轉(zhuǎn)氨酶（GABA-T)、以及位于線粒體調(diào)控 氧化還原反應的琥珀半醛脫氫酶（SSADH)，隨著研宄的深入，又發(fā)現(xiàn)位于胞質(zhì)和質(zhì)體由氧化 還原反應調(diào)控的乙醛酸/琥珀酸半醛還原酶也分別參與GABA轉(zhuǎn)運和代謝過程。研宄表明 GABA代謝途徑在逆境脅迫中的生物學功能與其區(qū)室化的結(jié)構(gòu)分布密切相關(guān)，但這個生化模 型并不能解釋不同物種和組織間GABA代謝途徑中同種類型酶之間的互補作用，及其轉(zhuǎn)錄 調(diào)控方面的差異（ShelpBJ，MullenRT，WallerJC. (2012)CompartmentationofGABA metabolismraisesintriguingquestions.TrendsPlantSci.，17 (2):57-59)〇
[0008] 近年來有關(guān)GABA代謝途徑的相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)、表達及功能一直是研究的熱 點之一。以往的研究大多是針對GABA合成途徑中的基因結(jié)構(gòu)、表達及功能進行的 解析（Bouche'N，F(xiàn)rommH. (2004)GABAinplants:justametabolite?Trends PlantSci.，9(3):110-116;AkamaK,TakaiwaF. (2007)C-terminalextensionof riceglutamatedecarboxylase(0sGAD2)functionsasanautoinhibitorydomain andoverexpr