一種基于普魯蘭多糖的負(fù)載藥物和基因的載體、及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于普魯蘭多糖的負(fù)載藥物或/和 基因的雙功能載體、及其制備方法，還涉及該載體在藥物-載體傳送系統(tǒng)、基因-載體傳送 系統(tǒng)和藥物-基因-載體傳送系統(tǒng)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，化學(xué)藥物治療是重要的癌癥治療方法之一，但單獨(dú)使用化療藥物需要很大 的劑量才具有抗腫瘤功效，同時(shí)帶來一定的毒副作用，如阿霉素的心臟毒性。因此，化療藥 物同其他治療技術(shù)的聯(lián)合使用已成為一個(gè)新的研宄方向。近年來的研宄表明：癌癥是一種 基因病，是在外界環(huán)境因素的作用之下，人體細(xì)胞內(nèi)在原癌基因被激活和抑癌基因失去活 性的長(zhǎng)期逐漸演變過程。由此可見，基因治療對(duì)于腫瘤的根治有著極其重要的意義。
[0003] 基因治療是指利用合適的載體將外源基因?qū)氚屑?xì)胞，糾正基因異?；蛉毕?，進(jìn) 而達(dá)到治療疾病的目的，基因治療的關(guān)鍵在于是否存在轉(zhuǎn)染效率高、低毒的載體將治療基 因（如抑癌基因P53等）導(dǎo)入靶細(xì)胞。
[0004] 常見基因載體包括病毒載體和非病毒載體兩類。盡管病毒載體具有較好的基因遞 送功效，但易引起免疫學(xué)反應(yīng)，且生產(chǎn)成本高。病毒載體的種種缺點(diǎn)使得人們將研宄重點(diǎn)逐 漸轉(zhuǎn)向非病毒載體，目前的非病毒基因載體主要包括脂質(zhì)體、多聚物載體和天然多糖類物 質(zhì)。例如，聚乙烯亞胺是一種常見的高效多聚物載體，因其結(jié)構(gòu)中含有大量氨基，可以利用 靜電作用結(jié)合帶負(fù)電的DNA形成復(fù)合物，同時(shí)又具有"質(zhì)子海綿效應(yīng)"，利于復(fù)合物進(jìn)行核 內(nèi)體逃逸，進(jìn)而將運(yùn)載的DNA有效運(yùn)送至細(xì)胞核內(nèi)。但聚乙烯亞胺存在細(xì)胞毒性較大的缺 點(diǎn)，為解決這一問題，有研宄者使用聚乙二醇對(duì)聚乙烯亞胺進(jìn)行修飾，降低復(fù)合物與血液中 蛋白質(zhì)之間的相互作用，提高血液循環(huán)時(shí)間，但是單一的基因治療亦難以長(zhǎng)期有效地抑制 癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，化療藥物同基因治療的聯(lián)合使用成為腫瘤治療中的一個(gè)重要研宄方 向。
[0005] 普魯蘭多糖是一種安全無毒、生物相容性良好、具有肝靶向性的天然多糖易溶于 水和二甲基亞砜，富含羥基，化學(xué)性質(zhì)較活潑，可以通過酯化反應(yīng)、酰胺化反應(yīng)以及羧甲基 化反應(yīng)將疏水性化合物連接到普魯蘭多糖的主鏈上，賦予其兩親性，繼而在水溶液中通過 疏水作用自組裝形成納米膠束，作為抗癌藥物的可控釋放載體；也可以在普魯蘭多糖的主 鏈上連接以帶正電的化合物，得到可運(yùn)載治療基因的載體，將治療基因?qū)氲郊?xì)胞內(nèi)以糾 正自身缺陷，恢復(fù)患者健康。由于普魯蘭多糖本身的生物相容性良好，由之改性得到的基因 載體具有較低的細(xì)胞毒性。然而，現(xiàn)有研宄大多是將普魯蘭多糖改性后，用于單一的藥物載 體或基因載體研宄，本發(fā)明使用硬脂酸和支鏈型聚乙烯亞胺同時(shí)對(duì)普魯蘭多糖進(jìn)行修飾， 制備得到兼具藥物傳遞和基因傳遞兩種功能的納米載體Pullulan-SA-PEI，尚未見該類載 體的報(bào)道，這種新型納米載體的研宄將為納米給藥系統(tǒng)抗腫瘤治療提供新思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種基于普魯蘭多糖的負(fù)載藥物或/和 基因的雙功能載體、及其制備方法和應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種基于普魯蘭多糖的用于負(fù)載藥物或/和基因 的載體，所述的載體以硬脂酸為疏水核心，以普魯蘭多糖和低分子量聚乙烯亞胺為親水外 殼，該載體具有式I的結(jié)構(gòu)：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于普魯蘭多糖的用于負(fù)載藥物或/和基因的載體，其特征在于：所述的載體 以硬脂酸為疏水核心，以普魯蘭多糖和低分子量聚乙烯亞胺為親水外殼，該載體具有式I 或式II的結(jié)構(gòu)：
式I中，m為5到24之間的整數(shù)，η為11到47之間的整數(shù)；式II中，η為9到45之間 的整數(shù)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述的低分子量聚乙烯亞胺為支鏈型聚 乙烯亞胺。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于：所述的低分子量聚乙烯亞胺的重均分子 量為500-2000Da，所述的普魯蘭多糖的平均分子量為30-200kDa，所述的硬脂酸接枝率為 3-10%，所述的低分子量聚乙稀亞胺接枝率以含氮量表不：為5-12%。
4. 如權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)所述的載體的制備方法，其特征在于，所述載體是將硬脂 酸和低分子量聚乙烯亞胺分別通過酯化反應(yīng)和酰胺化反應(yīng)依次接枝到普魯蘭多糖的骨架 上而制備得到的。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟： (1) 氮?dú)獗Ｗo(hù)下，普魯蘭多糖中加入硬脂酸和4-二甲氨基吡啶和1-乙基-(3-二甲基 氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸，在15-50°C下攪拌反應(yīng)30-70h，收集產(chǎn)物，產(chǎn)物經(jīng)透析純化、冷 凍干燥，得到普魯蘭-硬脂酸接枝聚合物；反應(yīng)溶劑為二甲基亞砜； (2) 氮?dú)獗Ｗo(hù)下，步驟（1)得到的普魯蘭-硬脂酸接枝聚合物中加入琥珀酸酐和4-二 甲氨基吡啶，在30-70°C下攪拌反應(yīng)5-30h，收集產(chǎn)物，產(chǎn)物經(jīng)透析純化、冷凍干燥，得到普 魯蘭-硬脂酸-琥珀酸酐接枝聚合物；反應(yīng)溶劑為二甲基亞砜； (3)氮?dú)獗Ｗo(hù)下，步驟（2)得到的普魯蘭-硬脂酸-琥珀酸酐接枝聚合物中，加入1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，在2-8°C下攪拌活化 2_8h，再加入低分子量聚乙烯亞胺，在15-50°C下攪拌反應(yīng)10_30h，經(jīng)透析純化、冷凍干燥， 得到普魯蘭-硬脂酸-聚乙烯亞胺接枝聚合物；反應(yīng)溶劑為磷酸鹽緩沖液； 其中： 步驟（1)中所述的普魯蘭多糖和硬脂酸的摩爾比為（1-5) :1-30 :1，硬脂酸、4-二甲 氨基吡啶和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽的摩爾比為I :(0.5-2): (1-2. 5)； 步驟（2)中所述的普魯蘭-硬脂酸接枝聚合物和琥珀酸酐的摩爾比為1 : (1-3)，4-二 甲氨基吡啶與琥珀酸酐的摩爾比為1 : (4-12)。 步驟（3)中所述的普魯蘭-硬脂酸-琥珀酸酐接枝聚合物中羧基與支鏈型聚乙烯亞 胺中氨基的摩爾比為1 : (〇. 1-5)，普魯蘭-硬脂酸-琥珀酸酐接枝聚合物中羧基、1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為1 : (0. 1-3): (0· 1-3)〇
6. -種藥物-基因-載體系統(tǒng)，包括載體和負(fù)載在所述載體上的疏水性抗癌藥物和基 因物質(zhì)，其中所述的載體為權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)所述的載體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物-基因-載體系統(tǒng)，其特征在于，所述的疏水性抗癌藥物 為阿霉素、紫杉醇、喜樹堿中的一種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物-基因-載體系統(tǒng)，其特征在于，所述的基因物質(zhì)為質(zhì)粒 DNA、染色體DNA、線粒體DNA中的一種。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物-基因-載體系統(tǒng)，其特征在于，所述的質(zhì)粒DNA為 p β Gal、p53 中的一種。
10. 權(quán)利要求6-9的任一項(xiàng)所述的藥物-基因-載體系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟： (1) 將載體和疏水性藥物攪拌混合，經(jīng)透析、冷凍干燥后得載體負(fù)載藥物系統(tǒng)； (2) 將所述載體負(fù)載藥物系統(tǒng)與基因物質(zhì)混合后室溫孵育，得到藥物-基因-載體系 統(tǒng)； 其中，疏水性藥物與載體的質(zhì)量比為I :(5-30);負(fù)載藥物系統(tǒng)與基因物質(zhì)的質(zhì)量比為 (0.01-80) :1 ;所述孵育時(shí)間為20-60min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于普魯蘭多糖的負(fù)載藥物或/和基因的雙功能載體Pullulan-SA-PEI，本發(fā)明通過酯化反應(yīng)和酰胺化反應(yīng)先后將硬脂酸和低分子量聚乙烯亞胺接枝到普魯蘭多糖主鏈上，制備出Pullulan-SA-PEI。本發(fā)明還公布了雙功能載體的應(yīng)用，Pullulan-SA-PEI在水溶性環(huán)境中可以自組裝形成膠束結(jié)構(gòu)，內(nèi)核包裹抗癌藥物，外殼吸附治療基因，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)藥物和基因的共傳遞。共傳遞體系可有效結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)pDNA，緩釋藥物，在吸附治療基因后，對(duì)癌細(xì)胞有較好的殺傷效果。雙功能載體Pullulan-SA-PEI在藥物緩釋和基因治療領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】C08G81-00, A61K9-107, A61K47-36, A61K48-00, C12N15-85, A61K31-4745, A61P35-00, C08B37-00, C12N15-87, A61K31-337, A61K31-704
【公開號(hào)】CN104651405
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510066829
【發(fā)明人】王靜云, 王曉紅, 陳麗麗, 夏菁, 王先武
【申請(qǐng)人】大連理工大學(xué)
【公開日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2015年2月6日