一種類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白介導(dǎo)的高效轉(zhuǎn)基因方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及了一種轉(zhuǎn)基因方法，尤其是涉及了轉(zhuǎn)基因生物領(lǐng)域中的一種類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白介導(dǎo)的高效轉(zhuǎn)基因方法。
【背景技術(shù)】
[0002]類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白(TALE)是從病原菌屬Xanthomonas spp中分離得到的保守的細(xì)菌性效應(yīng)蛋白，是一類可以特異識別DNA序列的蛋白。至今為止TALE已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因打靶、內(nèi)源基因的定點(diǎn)調(diào)控和定點(diǎn)的表觀遺傳修飾。
[0003]在過去的十多年中,piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于大量的脊椎動物和非脊椎動物，成為了強(qiáng)大的遺傳操作工具，在制備轉(zhuǎn)基因動物和插入誘變等研究上發(fā)揮重要的作用。但是，PiggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因效率依舊較低，而且轉(zhuǎn)化效率不穩(wěn)定，近年來家蠶上的平均轉(zhuǎn)基因效率僅為8.8%。因此，轉(zhuǎn)基因效率的低下給研究人員增加了很大的工作負(fù)擔(dān)，很大程度上限制了該技術(shù)的進(jìn)一步的推廣和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決【背景技術(shù)】中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白介導(dǎo)的高效轉(zhuǎn)基因方法，大大提高了 PiggyBac介導(dǎo)的在家蠶中的轉(zhuǎn)基因效率。
[0005]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案的步驟如下:
[0006]I)采用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建包含類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白(TALE)DNA序列和piggyBac轉(zhuǎn)座酶(PBase)DNA序列的輔助質(zhì)粒,該質(zhì)粒表達(dá)有TALE-PBase融合蛋白，將該輔助質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)錄成mRNA ；
[0007]2)采用顯微注射法將作為轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒的mRNA與含有外源基因的piggyBac轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒的DNA —起導(dǎo)入到動物的受精卵中，獲得外源基因能夠穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動物；
[0008]3)根據(jù)標(biāo)志基因或基因的表達(dá)特征篩選出轉(zhuǎn)基因陽性個(gè)體。
[0009]所述的輔助質(zhì)粒中的類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白DNA序列包括16個(gè)重復(fù)的DNA序列。
[0010]所述的輔助質(zhì)粒中的類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白DNA序列和piggyBac轉(zhuǎn)座酶DNA序列之間的Linker序列長度為209bp。
[0011]所述的輔助質(zhì)粒中的類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白序列位于PBase序列的5’端，類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白序列和PBase序列表達(dá)后為一個(gè)融合蛋白。
[0012]所述的piggyBac轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒中含有至少一種外源基因的表達(dá)框。
[0013]由本發(fā)明實(shí)施例，piggyBac轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒包含有綠色熒光蛋白基因(EGFP)、紅色熒光蛋白基因(DsRed)和家蠶絲素輕鏈啟動子啟動人血清白蛋白(HSA)中的一種或者多種的表達(dá)框。
[0014]本發(fā)明具有的有益效果是:
[0015]本發(fā)明極大地推動了轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，將目前piggyBac介導(dǎo)的在家蠶中的轉(zhuǎn)基因效率至少提高了 7倍，這將是轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展中的一次重要突破。同時(shí)，其它動物的piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因效率也因本技術(shù)的發(fā)明而得到顯著提高。因此，在今后的研究中，獲得轉(zhuǎn)基因動物將會變得非常容易，這很大程度上簡化了轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的過程，也節(jié)省了大量的人力和物力。
【附圖說明】
[0016]圖1是本發(fā)明TALE-PBase新型輔助質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
[0017]圖2是實(shí)施例1具有3XP3-EGFP表達(dá)框的piggyBac轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
[0018]圖3是實(shí)施例3具有3XP3-DsRed和FL-HSA兩個(gè)表達(dá)框的piggyBac轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0020]實(shí)施例1:
[0021]以提高動物轉(zhuǎn)基因效率為研究目的，構(gòu)建了一個(gè)包含類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)蛋白(TALE)DNA序列和piggyBac轉(zhuǎn)座酶(PBase)DNA序列(基因如SEQ ID N0.5)的新型輔助質(zhì)粒(圖1)。具體方法是:先組裝TALE序列(如SEQ ID N0.3)的3’端(C00N端)連接一個(gè)PBase序列，與前面的TALE序列在同一個(gè)編碼框內(nèi)，用于表達(dá)TALE-PBase融合蛋白，TALE與PBase之間有I個(gè)209bp長度連接序列(Linker)(如SEQ ID N0.4)連接；在TALE的5，端(順2端)構(gòu)建一個(gè)SP6原核啟動子(如SEQ ID N0.1)，該啟動子可以將下游基因在體外轉(zhuǎn)錄成mRNA ;還構(gòu)建了一個(gè)核定位序列(NLS)(如SEQ ID N0.2)，用于引導(dǎo)TALE-PBase融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞核。
[0022]同時(shí)還構(gòu)建了包含3XP3-EGFP-SV40 Poly A結(jié)尾的表達(dá)框的piggyBac轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒DNA (如SEQ ID N0.5)(圖2)，其中ITR為piggyBac轉(zhuǎn)座子的反向重復(fù)序列，綠色熒光蛋白基因EGFP(如SEQ ID N0.6)由3XP3啟動子(如SEQ ID N0.9)啟動轉(zhuǎn)錄，在動物的眼睛和神經(jīng)組織中能夠特異表達(dá)綠色熒光。
[0023]將新型輔助質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后與3XP3-EGFP轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒DNA —起溶解在沒有RNA酶的pH7.6磷酸緩沖液中。磷酸緩沖液中3XP3-EGFP轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒DNA的濃度為300ng/ μ L，新型輔助質(zhì)粒的mRNA濃度為200ng/ μ L。
[0024]以家蠶為模式生物，采用顯微注射法將混合的DNA和mRNA溶液注入家蠶P50品種產(chǎn)卵后4小時(shí)內(nèi)的受精卵中，注射總體積為1nl左右。注射后的蠶卵在25°C溫度、85%濕度、12h光照的條件下飼養(yǎng)至成蟲(G0代)，每個(gè)GO代蛾子與野生型的蛾子交配得到Gl代。得到的Gl代家蠶用日本Olympus SZX12熒光顯微鏡，篩選出眼睛特異表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP)的陽性家蠶。
[0025]實(shí)驗(yàn)總共注射了 850個(gè)家蠶受精卵，成功孵化了 71條家蠶，最終得到58個(gè)Gl代蛾圈。在這58個(gè)蛾圈中總共篩選得到37個(gè)陽性蛾圈，所以轉(zhuǎn)基因效率為63.8% (37/58)。
[0026]實(shí)施例2:
[0027]TALE-PBase融合蛋白表達(dá)載體以及包含3XP3-EGFP表達(dá)框的轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒DNA的構(gòu)建方法如實(shí)施例1，實(shí)施例2的輔助質(zhì)粒與包含3XP3-EGFP表達(dá)框的轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒DNA均與實(shí)施例1相同。
[0028]將本發(fā)明新型輔助質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后與3 X P3-EGFP轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒DNA —起溶解在沒有RNA酶的pH7.6磷酸緩沖液中。磷酸緩沖液中3XP3-EGFP轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒DNA的濃度為300ng/ μ L，新型輔助質(zhì)粒mRNA的濃度為200ng/ μ L。
[0029]以家蠶為模式生物，采用顯微注射法將混合的DNA和mRNA溶液導(dǎo)入P50品種家蠶產(chǎn)卵后4小時(shí)內(nèi)的受精卵中，注射總體積為1nl左右。注射后的蠶卵在25°C溫度、85%濕度、12h光照的條件下飼養(yǎng)至成蟲(G0代)，每個(gè)GO代蛾子與野生型的蛾子交配得到Gl代。得到的Gl代蛾圈用日本Olympus SZX12熒光顯微鏡，篩選出眼睛特異表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP)的陽性家蠶。
[0030]實(shí)驗(yàn)總共注射了 900個(gè)家蠶受精卵，成功孵化了 75條家蠶，最終得到36個(gè)Gl代蛾圈。在這36個(gè)蛾圈中總共篩選得到23個(gè)陽性蛾圈，所以轉(zhuǎn)基因效率為63.9% (23/36)。
[0031]實(shí)施例3:
[0032]TALE-PBase融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法如實(shí)施例1。同時(shí)構(gòu)建了包含3XP3-DsRed和FL-HSA兩個(gè)表達(dá)框的piggyBac轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒(圖3)，SV40 Poly A (如SEQID N0.12)和家蠶絲素輕鏈(FL)Poly A(堿基如SEQ ID N0.13，肽如SEQ ID N0.1)分別為2個(gè)表達(dá)框的結(jié)尾信號；該質(zhì)粒中3XP3啟動子啟動紅色熒光蛋白(DsRed)(基因如SEQ IDN0.10，氨基酸如SEQ ID N0.11)特異的在眼中表達(dá)紅色熒光；家蠶絲素輕鏈啟動子啟動人血清白蛋白(HSA)(如SEQ ID N0.15)特異的在家蠶后部絲腺中表達(dá)，絲素輕鏈信號肽能夠促使人血清白蛋白從細(xì)胞分泌到家蠶絲腺腔內(nèi)。
[0033]將新型輔助質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)錄成mRNA,然后與3XP3-DsRed-FL_HSA的piggyBac轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒DNA —起溶解在沒有RNA酶的pH7.6磷酸緩沖液中。磷酸緩沖液中3XP3-DsRed-FL-HSA轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒DNA的濃度為200ng/ μ L，新型輔助質(zhì)粒mRNA的濃度為200ng/μ L。
[0034]以家蠶為模式生物，采用顯微注射法將混合的DNA和mRNA溶液導(dǎo)入LanlO品種家蠶產(chǎn)卵后4小時(shí)內(nèi)的受精卵中，注射總體積為1nl左右。注射后的蠶卵在25°C溫度、85%濕度、12h光照的條件下飼養(yǎng)至成蟲(GO代)，每個(gè)GO代蛾子與野生型的蛾子交配得到Gl代。得到的Gl代蛾圈用日本Olympus SZX12熒光顯微鏡，篩選出眼睛特異表達(dá)紅色熒光蛋白(DsRed)的陽性家蠶。
[0035]實(shí)驗(yàn)總共注射了 1100個(gè)家蠶受精卵，成功孵化了 234條家蠶，最終得到103個(gè)Gl代蛾圈。在這103個(gè)蛾圈中總共篩選得到56個(gè)陽性蛾圈，所以轉(zhuǎn)基因效率為54.4%(56/103)。采用SDS-PAGE電泳和Western blot技術(shù)分析轉(zhuǎn)基因家蠶HSA蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果得到與預(yù)期分子量大小相符的特異性蛋白條帶。SDS-PAGE電泳條帶灰度分析顯示，人血清白蛋白占蛋白溶液中總蛋白含量可達(dá)29.1%,占繭層重的2.11%。
[0036]綜上所述，證明本發(fā)明的TALE-PBase融合蛋白可以顯著地提高piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因效率；即使增大PiggyBac轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒DNA的大小，如增加I個(gè)表達(dá)框FL-HAS，結(jié)果并沒有導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因效率的顯著降低(P >0.05) ;3次不同實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)了TALE-PBase融合蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因效率是穩(wěn)定的，這就充分說明了本發(fā)明高效轉(zhuǎn)基因方法的可靠性，具有突出顯著的技術(shù)效果。
[0037]實(shí)施例中的piggyBac轉(zhuǎn)座子首次在鱗翅目昆蟲粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細(xì)胞系TN-368中發(fā)現(xiàn)。之后，該轉(zhuǎn)座子在地中海果蠅(Ceratitis capitata)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和家香(Bombyx mori L.)等昆蟲中的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)均取得了成功。后來研究還證明PiggyBac轉(zhuǎn)座子是一個(gè)廣譜的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，已經(jīng)在酵母(Schizosaccharomyces pombe)、真潤蟲(Girardia tigrina)、斑馬魚(Dan1rer1)、小鼠、雞、牛、豬、水稻和人細(xì)胞等物種中得到有效應(yīng)用。從無脊椎動物到有脊椎動物等多種生物中成功實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因。由此可見，雖然實(shí)施例采用的物種是家蠶，但本發(fā)明也同樣適用于其他物種，本發(fā)明同樣可以在其它物種中實(shí)現(xiàn)高效的轉(zhuǎn)基因。
[0038]上述【具體實(shí)施方式】用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0039]本發(fā)明所涉及的基因序列如下:
[0040]SEQ ID N0.1:SP6 啟動子序列
[0041]來源:SP6啟動子
[0042]5’ -ATTTAGGTGACACTATAGA-3’
[0043]SEQ ID N0.2:核定位信號(NLS)序列
[0044]來源:核定位信號(NLS)序列
[0045]5， -CCCAAGAAGAAGAGGAAGGTG-3，
[0046]SEQ ID N0.3 =TALE 序列
[0047]來源:TALE序列
[0048]5，-CTGACCCCAGAGCAGGTCGTGGCCATTGCCTCGAATGGAGGGGGCAAACAGGCGTTGGAAACCGTACAACGATTGCTGCCGGTGCTGTGCCAAGCGCACGGTTTAACCCCAGAGCAGGTCGTGGCAATCGCCTCCAACATTGGCGGGAAACAGGCACTCGAGACTGTCCAGCGCCTGCTTCCCGTGCTGTGCCAAGCGCACGGCCTCACCCCAGAGCAGGTCGTGGCGATCGCAAGCCACGACGGAGGAAAGCAAGCCTTGGAAACAGTACAGAGGCTGTTGCCTGTGCTGTGCCAAGCGCACGGATTAACCCCAGAGCAGGTCGTGGCCATTGCCTCGAATGGAGGGGGCAAACAGGCGTTGGAAACCGTACAACGATTGCTGCCGGTGCTTTGTCAGGCACACGGCCTCACTCCGGAACAAGTGGTCGCGATCGCAAGCCACGACGGAGGAAAGCAAGCCTTGGAAACAGTACAGAGGCTGTTGCCTGTGCTGTGCCAAGCGCACGGACTTACCCCAGAGCAGGTCGTGGCAATCGCGAGCAATAACGGCGGA