一種微生物厭氧發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)甘露醇和d-乳酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微生物厭氧發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)甘露醇和D-乳酸 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘露醇（D-Mannitol)，又名甘露糖醇，具有6個羥基，是一種六碳糖醇化合物。甜 度只有蔗糖的一半。相比其他糖類，由于甘露醇具有不吸濕，甜度適宜，熱量低，不致齲齒， 無毒副作用等特性，特別是甘露醇在代謝過程中不需要胰島素的參與，適宜作為糖尿病人 食品的甜味劑和各種功能性食品的添加劑。甘露醇在醫(yī)藥、食品和化工領(lǐng)域都有著非常廣 泛的應(yīng)用，是無糖口香糖的甜味劑或防粘劑的主要原料，目前甘露醇的市場規(guī)模已達到數(shù) 萬噸。
[0003] 傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)甘露醇主要有兩種方法：一種是天然提取法，海帶中含有少量甘露 醇，以海帶為原料生產(chǎn)海藻酸鹽的同時，將提碘后的海帶浸泡液，經(jīng)多次提濃、除雜、離子交 換、蒸發(fā)濃縮、冷卻結(jié)晶而得。天然提取法具有收率低，精制過程繁瑣，生產(chǎn)成本高，原料來 源受產(chǎn)地限制等缺點，并且甘露醇產(chǎn)品雜質(zhì)含量法，主要以鎳（Ni)為催化劑，在高溫高壓 下加氫還原果葡糖漿中的葡萄糖與果糖的混合物，其中葡萄糖全部轉(zhuǎn)化為山梨醇，果糖一 半轉(zhuǎn)化為甘露醇，但另一半也被轉(zhuǎn)化為山梨醇。催化加氫法存在一些局限：需要高純度原 料，如氫氣和昂貴的金屬催化劑等；需要較高的溫度和壓力；需要昂貴的色譜純化方法從 產(chǎn)品中除去鎳；該法副產(chǎn)大量結(jié)構(gòu)相似而附加值較低的山梨醇，增加了甘露醇的生產(chǎn)成本。
[0004] 微生物發(fā)酵法是指通過特定的微生物，利用糖類為底物發(fā)酵生成甘露醇的方法。 發(fā)酵生產(chǎn)甘露醇具有反應(yīng)條件溫和，容易控制，并且不副產(chǎn)山梨醇，因此是甘露醇生產(chǎn)的研 宄熱點。例如專利201310081411. 3報道了一種利用近平滑假絲酵母發(fā)酵法產(chǎn)甘露醇的方 法，150g/L葡萄糖可產(chǎn)30g/L甘露醇。專利201310643082. 7構(gòu)建了一株表達蔗糖水解酶和 甘露醇脫氫酶的重組大腸桿菌，該菌以蔗糖為底物，通過補料分批發(fā)酵可產(chǎn)45g/L甘露醇， 但轉(zhuǎn)化率只有37. 66%。專利200810229066. 2利用多種乳酸菌以菊芋為原料厭氧發(fā)酵制備 甘露醇，通過補料發(fā)酵方式，產(chǎn)甘露醇160g，對總糖的轉(zhuǎn)化率為81. 5%，但發(fā)酵培養(yǎng)基中的 蛋白胨添加量達3%，導(dǎo)致氮源成本過高，削弱了其經(jīng)濟性。由此可見乳酸菌的甘露醇轉(zhuǎn)化 率較高，但需要添加大量昂貴氮源，導(dǎo)致成本較高。
[0005] 乳酸是一種重要的有機酸產(chǎn)品，根據(jù)其光學(xué)構(gòu)型，可分為L-乳酸，D-乳酸和D、 L-乳酸。聚乳酸是已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化的生物可降解塑料，但耐熱性較差，目前研宄表明：添加一定 比例的聚D-乳酸可顯著提高聚乳酸的熔點，這將大大拓展聚乳酸材料的市場。此外，D-乳 酸還是生產(chǎn)多種高效除草劑的原料。目前D-乳酸的價格是L-乳酸的數(shù)倍，具有較高的市 場價值。目前發(fā)酵法是D-乳酸的主要生產(chǎn)方法，利用產(chǎn)乳酸微生物專一性生產(chǎn)高光學(xué)純度 的D-乳酸已有報道，如專利200810098908. 5和專利201010241912. X均是利用乳桿菌生產(chǎn) D-乳酸。但這些方法為了提高D-乳酸產(chǎn)量，在發(fā)酵過程中添加鈣鹽中和乳酸來控制pH，高 濃度的鈣鹽給后續(xù)分離帶來了很多的壓力，同時副產(chǎn)的硫酸鈣由于含有大量色素和雜質(zhì)， 很難利用，造成嚴重的廢渣污染。
[0006] 因此利用同一種乳酸菌以相對低廉的發(fā)酵原料在厭氧發(fā)酵過程中聯(lián)產(chǎn)甘露醇合 D-乳酸，將有利于大幅度降低發(fā)酵法制備甘露醇的成本，并可獲得高光學(xué)純度的D-乳酸產(chǎn) 品，是一種較為經(jīng)濟的生產(chǎn)手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種微生物厭氧發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)甘露醇和D-乳酸的 方法。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0009] 一種微生物厭氧發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)甘露醇和D-乳酸的方法，以果葡糖漿II為碳源配制發(fā) 酵培養(yǎng)基，經(jīng)過微生物厭氧發(fā)酵同時生產(chǎn)甘露醇和D-乳酸；
[0010] 其中，所述的微生物為假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides) G123 CCTCC NO :M 2014115 ;該菌株公開在發(fā)明人另一篇中國專利CN103992978A中。
[0011] 其中，所述的果葡糖漿II，果糖與葡萄糖的質(zhì)量比為2~4:1。
[0012] 上述微生物厭氧發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)甘露醇和D-乳酸的方法具體包括如下步驟：
[0013] (1)種子液培養(yǎng)：
[0014] 一級種子培養(yǎng)：將-80°c保存的假腸膜明串珠菌G123菌液在常溫下解凍后，按1% v/v接種于一級種子培養(yǎng)基，30°C、200rpm，好氧培養(yǎng)12~14h ;
[0015] 其中，所述的一級種子培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、 乙酸鈉5g/L、檸檬酸三銨2g/L、三水合磷酸氫二鉀2g/L、七水合硫酸鎂0. 2g/L、一水合硫酸 錳0. 05g/L、吐溫-801mL/L，以果葡糖漿I作為碳源，總糖20g/L，培養(yǎng)基在121°C下滅菌處 理20min ;其中，所述的果葡糖漿I，果糖與葡萄糖的質(zhì)量比為1~3 :1 ;
[0016] 二級種子培養(yǎng)：以5% v/v的接種量從一級種子液轉(zhuǎn)接至二級種子培養(yǎng)基，30°C， 200rpm，無菌空氣通氣量為0? lvvm，初始為pH 7. 5,其后pH控制在pH5. 5,培養(yǎng)8~10h ;
[0017] 其中，所述的二級種子培養(yǎng)基配方為：酵母粉5g/L、蛋白粉5g/L、乙酸鈉2g/L、檸 檬酸三銨2g/L、三水合磷酸氫二鉀2g/L、七水合硫酸鎂0. 2g/L、一水合硫酸錳0. 05g/L，以 果葡糖漿I作為碳源，總糖20g/L，培養(yǎng)基在121°C下滅菌處理20min ;其中，所述的果葡糖 漿I，果糖與葡萄糖的質(zhì)量比為1~3 :1 ;
[0018] (2)厭氧發(fā)酵培養(yǎng)：
[0019] 將二級種子液以6% v/v接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，無菌氮氣的通氣量為 0? 05~0? lvvm，初始為pH 6. 0~7. 5,其后pH控制在4. 5~5. 5,發(fā)酵溫度30~35°C， 150rpm，采用分批發(fā)酵或補料分批發(fā)酵模式；
[0020] 其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：有機氮源1~5g/L、三水合磷酸氫二鉀2g/L、 七水合硫酸鎂0. 2g/L、一水合硫酸錳0. 05g/L，以果葡糖漿II作為碳源，初始總糖濃度為 60~120g/L，培養(yǎng)基在121°C下滅菌處理20min ;其中，所述的果葡糖漿II，果糖與葡萄糖 的質(zhì)量比為2~4 :1 ;
[0021] (3)提?。?br>[0022] (3a)取步驟（2)所得的發(fā)酵液去除菌體，然后經(jīng)過超濾去除雜蛋白、活性炭柱連 續(xù)脫色，將脫色液中的甘露醇濃縮至30~40wt%，然后濃縮液冷卻至常溫；在以上甘露醇 的提取過程中，聯(lián)產(chǎn)的D-乳酸被同步濃縮；
[0023] (3b)向步驟（3a)得到的濃縮液中加入乙醇水溶液，攪拌混合后冷卻至0°C結(jié)晶， 養(yǎng)晶8~12h，通過離心或真空過濾得到甘露醇晶體；通過蒸發(fā)法回收結(jié)晶母液中的乙醇回 用于甘露醇的提??；
[0024] (3c)步驟（3b)回收乙醇后的結(jié)晶母液通過納濾膜將殘余的甘露醇及磷酸鹽、硫 酸鹽與D-乳酸分離，回收的甘露醇返回至步驟（3a)超濾工段套用，提取收率達到90%以 上；用濃硫酸將納濾透過液調(diào)節(jié)至PH3. 5,將分離出的D-乳酸溶液被濃縮至40~50wt %， 獲得D-乳酸粗品；
[0025] (3d)將步驟（3c)得到的D-乳酸粗品分別經(jīng)過強酸性陽離子樹脂和弱堿性陰離子 樹脂脫除其中的雜質(zhì)離子和少量色素，精制后的乳酸溶液被濃縮至D-乳酸含量達85wt%， D_乳酸光學(xué)純度為99%以上，其分離收率達85%左右。具體提取流程見圖1。
[0026] 步驟⑴中，pH的調(diào)控方法為，接種前將一級種子培養(yǎng)基和二級種子培養(yǎng)基的pH 值調(diào)控為