基于顯微圖像分析的稻瘟病菌孢子檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種稻瘟病菌孢子檢測(cè)方法，尤其是一種基于顯微圖像分析的稻瘟病 菌孢子檢測(cè)方法，屬于稻瘟病檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 選育和種植抗性品種是防控稻瘟病的有效措施，在稻瘟病室內(nèi)抗性鑒定中，病菌 懸浮液中孢子的數(shù)量是影響抗性鑒定結(jié)果的重要因素，當(dāng)懸浮液中的孢子數(shù)量不符合接種 要求時(shí)，將會(huì)錯(cuò)誤地評(píng)估水稻品種的抗性等級(jí)；此外，稻瘟病的發(fā)生及病害的嚴(yán)重程度與一 定區(qū)域內(nèi)病菌（分生孢子）的數(shù)量密切相關(guān)。因此，研宄快速、準(zhǔn)確的稻瘟病菌孢子檢測(cè)方 法無(wú)論對(duì)稻瘟病的抗性鑒定還是田間病害監(jiān)測(cè)都具有重要意義。
[0003] 病菌的常用檢測(cè)方法有平板菌落計(jì)數(shù)法、顯微鏡下人工計(jì)數(shù)法、比濁法和流式細(xì) 胞儀測(cè)定法等。平板菌落計(jì)數(shù)法的成本低，但其勞動(dòng)強(qiáng)度大、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)；顯微鏡下人工計(jì) 數(shù)法適用于體積較大菌體的檢測(cè)，對(duì)于個(gè)體較小的菌體操作工作量和誤差較大；比濁法成 本較高，適用于菌體分散良好且干擾少的細(xì)菌；流式細(xì)胞儀測(cè)定法檢測(cè)速度快，精度高，但 設(shè)備儀器昂貴。
[0004] 目前，在植物病菌孢子檢測(cè)方面，通常是操作人員根據(jù)顯微鏡下病菌孢子的形態(tài) 特征完成檢測(cè)和計(jì)數(shù)，由于顯微圖像中孢子個(gè)體小、數(shù)量大、雜質(zhì)多，利用人工計(jì)數(shù)方法費(fèi) 時(shí)費(fèi)力，且易造成較大計(jì)數(shù)誤差。因此，為了提高稻瘟病菌孢子檢測(cè)的準(zhǔn)確率和自動(dòng)化水 平，需要研宄=一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效的孢子檢測(cè)和計(jì)數(shù)方法。
[0005] 雖然顯微圖像處理技術(shù)檢測(cè)稻瘟病菌的研宄未見(jiàn)報(bào)道，但是已有一些學(xué)者利用顯 微圖像技術(shù)檢測(cè)其他植物病原菌的研宄：l)Chesmore等（ChesmoreD，BernardT，InmanA J，etal..ImageanalysisfortheidentificationofthequarantinepestTilletia indica[J].EPPOBulletin，2003,33(3) :495-499.)利用病害圖像研究小麥印度腥黑穗病 孢子和黑麥草腥黑穗病菌孢子的分類，該研宄從病害圖像中自動(dòng)定位孢子，并提取其周長(zhǎng)、 表面積、突起數(shù)及突起的大小、最大（小）半徑和圓形度等相關(guān)參數(shù)作為分類依據(jù)；2)張俊 祥等（張俊祥，肖茜，方呈祥，等.噬菌斑電子圖像的計(jì)算機(jī)處理及其自動(dòng)計(jì)數(shù)[J].中國(guó) 病毒學(xué)，2003，18 (4) :387-390.)將噬菌斑制成電子圖像，抽取圖像中有代表性的區(qū)域，利 用分水嶺算法對(duì)圖像進(jìn)行分割處理，將相連的噬菌斑分割成單獨(dú)的噬菌斑，然后利用區(qū)域 生長(zhǎng)法進(jìn)行計(jì)數(shù)；3)張榮標(biāo)等（張榮標(biāo)，黃義振，孫曉軍，等.基于圖像處理的圓褐固氮菌 濃度快速檢測(cè)方法[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2012,43(10) : 174-178.)通過(guò)對(duì)圓褐固氮菌微視圖 像的采集、預(yù)處理、分割和特征提取，運(yùn)用SVM進(jìn)行識(shí)別、分類和計(jì)數(shù)，獲取圓褐固氮菌的濃 度，實(shí)現(xiàn)了圓褐固氮菌活性的快速檢測(cè)；4)鄧?yán)^忠等（鄧?yán)^忠，李敏，袁之報(bào)，等.基于圖像 識(shí)別的小麥腥黑穗病害特征提取與分類[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2012(03) :172-176.)利用小 麥腥黑穗病害顯微圖像，采用圖像分析與識(shí)別技術(shù)進(jìn)行了小麥的矮腥、印度腥及網(wǎng)腥3類 病害的分類識(shí)別。通過(guò)分析，從病害孢子圖像的16個(gè)形狀和紋理特征中，選擇長(zhǎng)軸、短軸、 等價(jià)橢圓短軸、周長(zhǎng)、面積和熵6個(gè)典型特征用于分類，并基于線性核函數(shù)建立支持向量機(jī) 模型，對(duì)這3種小麥腥穗病害進(jìn)行分類鑒定，總體識(shí)別率達(dá)到82.9% ;5)李小龍等（李小 龍，馬占鴻，孫振宇，等.基于圖像處理的小麥條銹病菌夏孢子模擬捕捉的自動(dòng)計(jì)數(shù)[J].農(nóng) 業(yè)工程學(xué)報(bào)，2013(2) :199-206.)利用孢子捕捉器捕捉小麥條銹病菌夏孢子，運(yùn)用顯微鏡 照相技術(shù)獲得孢子圖像，對(duì)圖像進(jìn)行基于最近鄰插值法的縮放處理、基于K-means聚類算 法的分割處理、形態(tài)學(xué)操作修飾和分水嶺分割等一系列的處理，實(shí)現(xiàn)夏孢子的自動(dòng)計(jì)數(shù)和 記D
[0006] 通常稻瘟病菌孢子在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)時(shí)，放大倍數(shù)為10X10,此時(shí)，孢子中間部 位透明，只含有邊界信息，而有時(shí)邊界信息并不清晰，給圖像處理帶來(lái)很大困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了一種基于顯微圖像分析的 稻瘟病菌孢子檢測(cè)方法，該方法能實(shí)現(xiàn)稻瘟病菌孢子數(shù)量的快速、準(zhǔn)確的自動(dòng)檢測(cè)，可為稻 瘟病室內(nèi)抗性鑒定過(guò)程提供技術(shù)支持。
[0008] 本發(fā)明的目的可以通過(guò)采取如下技術(shù)方案達(dá)到：
[0009] 基于顯微圖像分析的稻瘟病菌孢子檢測(cè)方法，所述方法包括：制備孢子懸浮液； 利用稻瘟病菌孢子圖像檢測(cè)系統(tǒng)獲取孢子懸浮液中的孢子顯微圖像；然后利用圖像光照校 正、中值濾波、邊緣檢測(cè)、形態(tài)學(xué)運(yùn)算對(duì)孢子顯微圖像進(jìn)行處理，并結(jié)合形狀特征參數(shù)，提取 出只含孢子的顯微圖像；最后采用改進(jìn)分水嶺算法對(duì)粘連孢子進(jìn)行分離，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)顯微圖 像中孢子的檢測(cè)和數(shù)量統(tǒng)計(jì)。
[0010] 作為一種實(shí)施方案，所述稻瘟病菌孢子圖像檢測(cè)系統(tǒng)包括顯微鏡、攝像機(jī)和計(jì)算 機(jī)，所述計(jì)算機(jī)中裝有NIS-ElementsBR圖像采集軟件，所述攝像機(jī)與計(jì)算機(jī)連接；
[0011] 所述利用稻瘟病菌孢子圖像檢測(cè)系統(tǒng)獲取孢子懸浮液中的孢子顯微圖像，具體如 下：
[0012] 用無(wú)菌的細(xì)口滴管將稀釋的孢子懸浮液在載玻片中央滴1小滴，蓋上清潔干燥的 蓋玻片，將載玻片放置在顯微鏡的載物臺(tái)上，選用放大倍數(shù)為10X10下觀察，找到目標(biāo)區(qū) 域，調(diào)節(jié)攝像機(jī)安裝位置，使圖像正確顯示在計(jì)算機(jī)的顯示器中，選擇與顯微鏡相適應(yīng)的場(chǎng) 景模式以及設(shè)置白平衡，通過(guò)計(jì)算機(jī)的圖像采集軟件采集稻瘟病菌孢子顯微圖像。
[0013] 作為一種實(shí)施方案，所述利用圖像光照校正、中值濾波、邊緣檢測(cè)、形態(tài)學(xué)運(yùn)算對(duì) 孢子顯微圖像進(jìn)行處理，具體包括以下步驟：
[0014] 1)圖像光照校正
[0015] 1. 1)圖像分塊：將圖像I(i，j)進(jìn)行MXN分塊，其中M=N= 4;
[0016] 1. 2)估算圖像背景的灰度：計(jì)算每個(gè)圖像塊的像素灰度均值y和標(biāo)準(zhǔn)差0，然后 以max(min，y-3 〇 )作為該區(qū)域的背景灰度；其中min為該區(qū)域像素的最小灰度值；
[0017] 1. 3)圖像光照不均勻校正：從原始圖像中減去步驟2)計(jì)算出的背景灰度圖像，以 校正光照不均勻；
[0018] 2)中值濾波
[0019] 采用3X3型濾波模板對(duì)光照校正后圖像進(jìn)行中值濾波處理；
[0020] 3)邊緣檢測(cè)
[0021] 采用Canny算子進(jìn)行圖像邊緣檢測(cè)，包括：3. 1)用高斯濾波器平滑圖像；3. 2)利 用一階偏導(dǎo)的有限差分來(lái)計(jì)算梯度的幅值和方向，得到梯度圖像；3. 3)對(duì)梯度幅值進(jìn)行非 極大值抑制；3. 4)用雙閾值算法檢測(cè)并且連接邊緣；
[0022] 4)形態(tài)學(xué)運(yùn)算
[0023] 根據(jù)孢子形態(tài)特征，采用8X