快速鑒定辣椒疫霉PcORP1基因核苷酸點(diǎn)突變及其對(duì)氟噻唑吡乙酮抗藥性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鑒定辣椒疫霉氧化固醇結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白PcORPI基因核苷酸點(diǎn) 突變的鑒定及其在殺菌劑氟噻唑吡乙酮抗性檢測(cè)中的應(yīng)用，具體公開一種快速鑒定辣椒疫 霉PcORPI基因核苷酸點(diǎn)突變及其對(duì)氟噻唑吡乙酮抗藥性的分子檢測(cè)方法及專用引物。屬 于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 辣椒疫霉（PhytophthoracapsiciLeonian)是一種重要的土傳植物病原卵菌，寄 主范圍廣泛，可侵染至少27科中的71種寄主植物。辣椒疫霉侵染辣椒引起的辣椒疫病，是 一種世界性分布的毀滅性病害，在我國(guó)普遍發(fā)生，且有逐年加重趨勢(shì)。在氣候適宜的條件 下，短期內(nèi)就可爆發(fā)，蔓延速度極快，一般發(fā)病可引起30%產(chǎn)量損失，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致絕產(chǎn)。
[0003]目前，化學(xué)防治以其速效和高效的特點(diǎn)，在辣椒疫霉等植物病原卵菌病害的防治 中依然發(fā)揮著不可替代的作用。但是隨著一些內(nèi)吸性殺菌劑的不合理頻繁使用，許多植物 病原卵菌已經(jīng)對(duì)其產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性。因此，國(guó)際上各大農(nóng)化公司一直致力于開發(fā)具有 全新作用機(jī)制且與市場(chǎng)上現(xiàn)有殺菌劑無(wú)交互抗藥性的新型殺菌劑，用于辣椒疫霉等植物病 原卵菌病害的防治和抗藥性治理。
[0004] 氟噻挫吡乙酮（oxathiapiprolin)即是美國(guó)杜邦公司2007年研發(fā)出的具有全 新化學(xué)結(jié)構(gòu)的新型植物病原卵菌抑制劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)包括了吡唑環(huán)、噻唑環(huán)及異惡唑啉環(huán) (W02008013925)，是迄今為止生物活性最高的一類卵菌抑制劑，也是21世紀(jì)最有代表性并 有望形成系列產(chǎn)品的新型殺菌劑，目前國(guó)際上殺菌劑抗藥性行動(dòng)委員會(huì)（FRAC)將這類殺 菌劑命名為哌啶基噻挫異惡挫啉類化合物（piperidinylthiazoleisoxazoline，PTIs)。 杜邦公司前期通過(guò)親和色譜等研宄，發(fā)現(xiàn)該藥劑的作用靶標(biāo)為人類氧化固醇結(jié)合蛋白同源 相關(guān)蛋白（oxysterolbindingprotein-relatedprotein，ORP) (W02013009971)，這是一 種全新的殺菌劑作用靶標(biāo)。
[0005] 目前，氟噻唑吡乙酮正在我國(guó)及全球不同地區(qū)申請(qǐng)登記用于防治辣椒疫霉菌，致 病疫霉，黃瓜霜霉病菌及葡萄霜霉病菌等植物病原卵菌的防治，具有廣闊的應(yīng)用前景。但 是，本研宄室通過(guò)藥劑馴化的方法得到了對(duì)氟噻唑吡乙酮產(chǎn)生高抗性水平的辣椒疫霉菌 株，并且部分抗性菌株的生存適合度較高，表明具有較高的抗性風(fēng)險(xiǎn)。因此，在使用氟噻唑 吡乙酮防治植物病原卵菌病害時(shí)需要關(guān)注并避免抗藥性的產(chǎn)生，加強(qiáng)檢測(cè)和早期預(yù)警病原 菌對(duì)氟噻唑吡乙酮的抗性發(fā)生發(fā)展情況，這有助于指導(dǎo)氟噻唑吡乙酮的科學(xué)使用，延緩抗 藥性的發(fā)生和發(fā)展，延長(zhǎng)藥劑的使用年限。
[0006] 殺菌劑抗性常規(guī)檢測(cè)方法包括：菌絲生長(zhǎng)速率法、菌絲干重測(cè)定法、孢子萌發(fā)測(cè)定 法和瓊脂展布法等。但是這些方法都需要先分離并純化病原菌，然后接種于帶藥培養(yǎng)基上 或接種于殺菌劑處理過(guò)的活體植株或組織上，一定時(shí)間之后才能調(diào)查結(jié)果。采用常規(guī)的方 法，當(dāng)田間抗藥性菌株的頻率> 1 %時(shí)，才能被檢測(cè)到（如有95%的概率檢測(cè)到1 %頻率的 抗藥性菌株，檢測(cè)的樣本量需大于300)，因此具有靈敏度低，工作量大，試驗(yàn)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。
[0007] 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展及其應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)展，限制性酶切PCR、等位 特異PCR分子技術(shù)開始在病原菌抗藥性檢測(cè)中應(yīng)用。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法比較，不但節(jié)省了 檢測(cè)時(shí)間、提高了工作效率，而且提高了檢測(cè)的靈敏度，檢測(cè)頻率在1〇_ 5~10 _4,更適用于檢 測(cè)低頻率的抗藥性基因，因此也被作為田間抗藥性早期診斷的理想方法。因此，分子檢測(cè)技 術(shù)將在病害的可持續(xù)管理系統(tǒng)中發(fā)揮愈來(lái)愈重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供兩種檢測(cè)或輔助檢測(cè)辣椒疫霉菌中PcORPl基因是否存 在突變位點(diǎn)的方法及其專用引物。
[0009] 本發(fā)明所提供的第一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)辣椒疫霉菌中PcORPl基因是否存在突變 位點(diǎn)的方法，包括如下步驟：
[0010] 以待測(cè)辣椒疫霉菌的基因組DNA為模板，用SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示引 物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為494bp的片段，則所述待測(cè)辣椒疫霉菌中PcORPl基 因存在或候選存在突變位點(diǎn)；
[0011] 所述突變位點(diǎn)指辣椒疫霉菌中PcORPl基因的基因組序列自5'末端起第2379位 核苷酸為G和T雜合或T純合。
[0012] 所述PcORPl基因的基因組序列自5'末端起第2379位核苷酸也就是SEQIDNO: 6中自5'末端起第2379位核苷酸。
[0013] 上述過(guò)程中，所述PCR擴(kuò)增中，退火溫度為54. 4°C。
[0014] 本發(fā)明所提供的第二種檢測(cè)或輔助檢測(cè)辣椒疫霉菌中PcORPl基因是否存在突變 位點(diǎn)的方法，包括如下步驟：
[0015] 以待測(cè)辣椒疫霉菌的基因組DNA為模板，用SEQ IDNO :3和SEQ IDNO :4所示引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用Pf1MI酶切所得部分PcORPl基因，若酶切產(chǎn)物中含有789bp和472bp 片段，則所述待測(cè)辣椒疫霉菌中PcORPl基因存在或候選存在突變位點(diǎn)；
[0016] 所述突變位點(diǎn)指辣椒疫霉菌中PcORPl基因的基因組序列自5'末端起第2379位 核苷酸為G和T雜合或T純合。
[0017] 所述PcORPl基因的基因組序列自5'末端起第2379位核苷酸也就是SEQ IDNO : 6中自5'末端起第2379位核苷酸。
[0018] 上述過(guò)程中，所述PCR擴(kuò)增中，退火溫度為60°C。
[0019] 本發(fā)明所提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)辣椒疫霉菌中PcORPl基因是否存在突變的引物 對(duì)，由SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示DNA分子組成。
[0020] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供辣椒疫霉菌中PcORPl基因或蛋白的突變位點(diǎn)。
[0021] 本發(fā)明所提供的辣椒疫霉菌中PcORPl基因的一個(gè)突變位點(diǎn)，為辣椒疫霉菌中 PcORPl基因的基因組序列自5'末端起第2379位核苷酸為G和T雜合或T純合。其中，所 述PcORPl基因的基因組序列自5'末端起第2379位核苷酸也就是SEQIDNO:6中自5'末 端起第2379位核苷酸。
[0022] 本發(fā)明所提供的辣椒疫霉菌中PcORPl蛋白的一個(gè)突變位點(diǎn)，為辣椒疫霉菌中 PcORPl蛋白的自N端起第769位氨基酸為甘氨酸與色氨酸雜合或純合的色氨酸。其中，所 述的PcORPl蛋白的白N端起第769位氨基酸也就是SEQIDNO:5中自N端起第769位氨 基酸。
[0023]上述任一所述突變位點(diǎn)在鑒定辣椒疫霉菌抗藥性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍；所述抗藥性為抗氟噻唑吡乙酮等PTIs殺菌劑。
[0024] 上述應(yīng)用中，存在所述突變位點(diǎn)的辣椒疫霉菌具有或候選具有抗藥性。
[0025] 本發(fā)明提供的檢測(cè)辣椒疫霉菌對(duì)氟噻唑吡乙酮產(chǎn)生抗藥性的點(diǎn)突變的方法，對(duì)抗 性菌株進(jìn)行高靈敏度、簡(jiǎn)單快速的分子檢測(cè)，及時(shí)了解抗藥性發(fā)生動(dòng)態(tài)，對(duì)制定合理的病害 管理方案、有效控制抗藥性病害發(fā)展具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為辣椒疫霉菌敏感和抗性菌株的序列對(duì)比。A:PcORPl基因的突變情況；B: PcORPl基因