一種基于coii基因的南亞乳白蟻熒光定量pcr分子檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物物種分子診斷領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種對(duì)南亞乳白蟻熒光定量PCR 分子檢測(cè)鑒定方法，以及在該方法中應(yīng)用到的檢測(cè)用探針和引物組合。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳白蟻危害廣泛，會(huì)造成非常嚴(yán)重的損失。其危害對(duì)象主要包括農(nóng)林作物、城市建 筑物、倉(cāng)儲(chǔ)物資、航運(yùn)鐵路、郵政設(shè)施、通訊電纜、文物古跡等。在白蟻主要活動(dòng)的東南亞及 我國(guó)南部地區(qū)，由于白蟻蛀害造成房屋倒塌的事件屢有發(fā)生。乳白蟻多數(shù)生活在山林，危害 樹(shù)木。乳白蟻因破壞林木使木材的利用率降低，或使木材的使用壽命降低，從而使木材加工 業(yè)受到直接或間接的損害。危害果樹(shù)毀壞木質(zhì)結(jié)構(gòu)的房屋而使古跡、旅游資源、建筑業(yè)受到 損害，由此造成潛在的經(jīng)濟(jì)影響是難以估量的。
[0003] 在與原木輸出國(guó)簽訂有關(guān)貿(mào)易協(xié)議時(shí)，應(yīng)訂明木材不得攜帶乳白蟻，或者在進(jìn)境 木材去皮或熏蒸處理時(shí)進(jìn)行乳白蟻除蟲(chóng)處理。凡發(fā)現(xiàn)進(jìn)境木材未有檢疫證書(shū)或攜帶有乳白 蟻的，一律進(jìn)行滅蟲(chóng)處理。使用化學(xué)藥劑如溴甲烷熏蒸，5% -10%亞砷酸鈉、1% -2%氯丹 乳劑噴灑，氯丹原油3% -5% +柴油95% -97%混合噴灑，可以有效地滅殺乳白蟻，也可以 用滅蟻靈在乳白蟻出沒(méi)的地方施藥，均可達(dá)到滿意的效果。
[0004] 南亞乳白蟻學(xué)名是CoptotermestraviansHaviland，也叫婆羅乳白蟻，已傳入澳 洲，主要分布在馬來(lái)西亞、印度、新加坡、印度尼西亞、巴基斯坦、緬甸，該種乳白蟻是南亞各 國(guó)危害建筑物的主要白蟻種類(lèi)之一。兵蟻頭部深黃色帶褐，寬卵形，長(zhǎng)明顯大于寬，長(zhǎng)寬相 差0. 25~0. 32_ ;頭部被適度和分散的長(zhǎng)短不一的剛毛；囟孔兩側(cè)各1根毛，前唇基白色， 上唇色和頭部相同，上唇透明區(qū)末端下方有兩根長(zhǎng)剛毛，上唇中區(qū)具一些短毛；后頦的前半 部亦有些剛毛；上顎暗褐色帶紅，基部帶黃褐色；腹部背板淡黃色，具一淡色中縱線帶從前 胸背板走向腹端。前胸背板的周緣和中區(qū)各具一些長(zhǎng)短不一的剛毛；腹背被濃密的毛。頭 兩側(cè)緣向前狹縮，在觸角隆線后面近直，囟小，孔口最大直徑〇. 10~〇. 11_。上唇長(zhǎng)稍大于 寬；側(cè)緣凸，兩側(cè)緣漸向前會(huì)聚于透明區(qū)端。上額近直，頂端稍向內(nèi)彎；左上顎基部具3~4 個(gè)小鈍齒；右上顎缺鈍齒，切邊近直或弱凸出。后須長(zhǎng)是最寬部的兩倍多，后頰最寬區(qū)幾為 最狹區(qū)寬的1. 5倍。前胸背板前緣凹刻較深；前側(cè)角窄圓形；側(cè)緣弱凸，向后傾斜；后側(cè)角 闊圓形；后緣中間凹刻淺。足中等長(zhǎng)；后腔長(zhǎng)〇. 80~0. 85mm。
[0005] 分子生物技術(shù)在白蟻分類(lèi)鑒定方面取得很多研宄成果。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù) (RandomAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD)由于對(duì)DNA模板純度要求較高，獲得的信 息量偏少且重復(fù)性差，不適合作為白蟻分子鑒定的手段。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 (RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)雖然比較穩(wěn)定、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，但 操作起來(lái)非常繁瑣，且放射性污染嚴(yán)重，也不宜采用（Alam，etal，2007 ;徐劉平等，2009)。 Husseneder等（2005)應(yīng)用簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記技術(shù)（SimpleSequenceRepeats,SSR)對(duì) 美國(guó)新奧爾良Armstrong公園的臺(tái)灣乳白蟻空間和社會(huì)組成，以及種群基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了描 述。該技術(shù)對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程的準(zhǔn)確度和精確度要求非常高，稍許差錯(cuò)就會(huì)對(duì)最終結(jié)果 造成很大影響。以上技術(shù)手段在白蟻研宄中進(jìn)行了有益的探索，但對(duì)于白蟻分子分類(lèi)鑒定、 遺傳進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育的研宄，目前仍未取得很好的成果，還需要更深入的探索研宄。
[0006] 現(xiàn)代分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)分類(lèi)技術(shù)在白蟻分類(lèi)上存在的局 限和不足，特別是PCR及其相關(guān)技術(shù)的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用為白蟻的分類(lèi)提供了新的、強(qiáng)有力的工 具和手段。線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)具有嚴(yán)格母性遺傳，相對(duì)較小的分子 質(zhì)量，世代間不發(fā)生重組，遺傳標(biāo)記豐富且易于提純等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物分類(lèi)、起 源、系統(tǒng)進(jìn)化、群體遺傳結(jié)構(gòu)等方面的研宄（Simon，1994)。而核糖體RNA基因16SrRNA 序列由于進(jìn)化速率較慢，常用于白蟻的種類(lèi)鑒定（Szalanski，2004)和分子系統(tǒng)發(fā)育分析 (Scheffrahn, 2004 ;Jenkins, 2007)。細(xì)胞色素C氧化酶I(cytochromecoxidasesubunit I，C0I)和細(xì)胞色素C氧化酶II(cytochromecoxidasesubunitII，C0II)基因變異較慢， 兼具有保守性和變異性的雙重特點(diǎn)，在鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等昆蟲(chóng)鑒定中得到了很好的 應(yīng)用。
[0007] 選擇適合作為乳白蟻屬內(nèi)種遺傳標(biāo)記基因的細(xì)胞色素氧化酶C0II基因片段，對(duì) 截獲率較高的檢疫性乳白蟻代表種及我國(guó)廣泛分布的臺(tái)灣乳白蟻（C.formosanus)不同地 理種群進(jìn)行比對(duì)分析，篩選特異性引物和探針，建立高特異性、高靈敏度、快速、有效的基于 "聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)"的南亞乳白蟻（C.travians)分子檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)南亞乳白蟻 不同品級(jí)的快速、穩(wěn)定和可靠的分子檢測(cè)鑒定，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法的不足，為我國(guó)乳 白蟻屬的分子分類(lèi)和近緣種鑒定的深入研宄奠定了良好基礎(chǔ)，對(duì)等翅目白蟻的分類(lèi)研宄有 非常重要的借鑒意義，研宄結(jié)果可直接應(yīng)用于進(jìn)出境植物檢疫中南亞乳白蟻的檢疫鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了一種快速、穩(wěn)定可靠、靈敏度高的南亞乳白蟻熒光定量PCR分子檢 測(cè)方法。所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于細(xì)胞色素氧化酶C0II 基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性檢測(cè)南亞乳白蟻（c.travians)的引物和熒光探針，并優(yōu)化反應(yīng)體系 和反應(yīng)程序，建立了實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)南亞乳白蟻的方法。特異性測(cè)試結(jié)果表明該方 法具有很強(qiáng)的特異性，可以從乳白蟻屬中10多種白蟻中特異性檢出南亞乳白蟻。該方法具 有靈敏度高，特異性強(qiáng)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
[0009] 根據(jù)測(cè)定的不同白蟻種群C0II序列以及從GenBank下載的其它乳白蟻序列運(yùn)用 DNAstar軟件MegAlign模塊進(jìn)行比對(duì)分析，依據(jù)其在C0II上的差異，設(shè)計(jì)特異性的引物和 探針，序列見(jiàn)序列表。南亞乳白蟻熒光檢測(cè)的特異性引物和探針都設(shè)計(jì)位于C0II，正反向引 物和探針?lè)謩e編號(hào)為CT-F、CT-R和CT-TZ，預(yù)測(cè)擴(kuò)增片段的大小為93bp。
[0010] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于南亞乳白蟻熒光定量PCR分子檢測(cè)鑒定方法， 其特征在于，所述方法包括：
[0011] 1)取單頭任意品級(jí)的白蟻樣本，在解剖鏡下剔除其體表的寄生蟲(chóng)及腹部?jī)?nèi)容物， 用蒸餾水將酒精和雜物漂洗干凈后，置于1. 5mLEppendorf管中，加入600y1TE緩沖液， 于56°C水浴浸泡2h，期間間歇振蕩；棄掉TE緩沖液，加入10y1提取液A(含1 %SDS， 50mmol/LTris.Cl，25mmol/LNaCl，25mmol/LEDTA)，置于-70°C冰箱中，5-10min后取 出，用燒融的槍頭搗碎，勻衆(zhòng)，再加入190y1提取液A，振蕩混勻后于65°C水浴45min;取出 后加入等體積提取液B(3mmol/L的KAC，PH為7. 2)，輕輕混勻后于冰上放置lh，12000g離 心15min，取上清于新的1. 5mLEppendorf管中，加入2倍體積無(wú)水乙醇沉淀DNA，12000g 離心151^