一種保存生物樣品的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種保存生物樣品的方法及試劑盒，廣泛應(yīng) 用于生物學(xué)、化學(xué)及醫(yī)學(xué)檢測(cè)反應(yīng)中基因疾病的診斷、監(jiān)測(cè)、生物庫的建立、分子診斷、PCR 擴(kuò)增、法醫(yī)、遺傳鑒定等。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物遺傳物質(zhì)（GM)，其中包括人或動(dòng)物的生理/病理體液（分泌物、滲出液等）； 人或動(dòng)物的細(xì)胞懸液（血液、淋巴液、滑膜液、精液、唾液等）；植物的生理/病理體液或者 細(xì)胞懸液；細(xì)菌、真菌、質(zhì)粒、病毒、寄生蟲等的提取液或者懸液；人或動(dòng)物機(jī)體組織（肝臟、 腎臟）提取液或者組織勻漿；DNA或者RNA合成過程的中間體；化學(xué)或生化合成的DNA/RNA 的混合物；其他任何可以提供液態(tài)GM的物質(zhì)。
[0003] 核酸是生物遺傳物質(zhì)，包括脫氧核糖核酸（DNA)及核糖核酸（RNA)。核酸檢測(cè)具有 現(xiàn)有分子檢測(cè)中最高的靈敏度及特異性，被廣泛用于以下幾個(gè)方面：傳染病病原微生物的 檢測(cè)、遺傳性疾病的診斷、血液中病毒的篩查、寄生蟲疾病的診斷及監(jiān)測(cè)（瘧疾）、人身份鑒 定如法醫(yī)DNA分析及親子鑒定、腫瘤疾病引起的血液中其他非正常細(xì)胞增殖的監(jiān)測(cè)、食品 安全及GMO檢測(cè)、健康咨詢等。
[0004] 然而上述所有的應(yīng)用均首先涉及生物樣品檢材的采集，之后將生物樣品運(yùn)輸至檢 測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行核酸提取及檢測(cè)。在這一系列的操作中面臨的最主要的問題是如何有效保存 待檢生物樣品中的核酸使之不被降解，同時(shí)滅活生物樣品中可能帶有的病原微生物以確保 操作者及大眾的安全。
[0005] 目前國內(nèi)外使用最廣泛的生物樣品的保存方法是通過采集血液或者唾液樣品保 存至各類保存卡上。商品化保存卡主要有英國Whatman公司生產(chǎn)的FTA系列保存卡。FTA 卡是Whatman專利產(chǎn)品，為在室溫下收集、運(yùn)輸和儲(chǔ)存核酸提供了穩(wěn)妥、安全、可靠的方法。 FTA卡經(jīng)過專利的化學(xué)配方浸漬，含有獨(dú)特的化學(xué)物質(zhì)，當(dāng)樣品吸附在卡上時(shí)，細(xì)胞膜和細(xì) 胞器被裂解，蛋白質(zhì)變性，釋放出的核酸被捕獲在FTA卡纖維上，使其免受核酸酶、氧化劑 和紫外線損傷及降解，在室溫條件下長期穩(wěn)定地保存。FTA卡可以快速地使有機(jī)體（包括血 液中的各種病原體）失活，并抑制細(xì)菌和其它微生物生長。樣品中的傳染性病原體在FTA 卡上5秒鐘內(nèi)失活。
[0006] 近期國內(nèi)一些企業(yè)紛紛致力于國產(chǎn)采集卡的研制，較有影響力的主要有天津諾維 萊博科技有限公司的DNA存儲(chǔ)卡、長春市博坤生物科技有限公司的生物樣本采集卡等，其 基本核心技術(shù)都同F(xiàn)TA技術(shù)較類似。
[0007] 英國Whatman公司的FTA系列保存卡可以在室溫條件下長期穩(wěn)定地保存DNA使其 免受降解。但其有眾多不足之處，包括：
[0008] 1、樣品轉(zhuǎn)移效率低：指示型FTA卡的樣品采集棒的設(shè)計(jì)不利于樣品的采集和轉(zhuǎn) 移，實(shí)際操作過程中樣品的轉(zhuǎn)移效率低。
[0009] 2、直接擴(kuò)增技術(shù)受限：由于FTA卡設(shè)計(jì)的初衷是以核酸分離提取為前提，而隨著 核酸擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展，直接擴(kuò)增技術(shù)已經(jīng)開始普遍應(yīng)用于法醫(yī)DNA分析中，使得FTA卡在直 接擴(kuò)增技術(shù)方面受到一定的限制。
[0010] 3、FTA卡保存過程中易褪色：目前市場(chǎng)上的大部分保存卡都設(shè)計(jì)成粉紅色，顏色 單一，其利用pH值的改變來指示樣品，當(dāng)無色的樣品如唾液，接觸到粉紅色的保存卡后，樣 品區(qū)由于pH值發(fā)生變化而產(chǎn)生顏色變化，由原來的粉紅色變成白色，從而可以用來指示樣 品區(qū)域。然而該方法仍存在一個(gè)問題，即濾紙卡在空氣中保存的過程中隨著保存時(shí)間的延 長及受保存條件、環(huán)境溫度、環(huán)境濕度、以及空氣中C02含量的影響，從而導(dǎo)致濾紙卡pH值 發(fā)生改變，粉紅色的樣品保存卡極易發(fā)生褪色現(xiàn)象。
[0011] 4、使用成本高：FTA卡是Whatman專利產(chǎn)品，價(jià)格昂貴，使用成本相當(dāng)高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種操作簡便、樣品轉(zhuǎn)移 效率高、能更有效殺滅細(xì)菌、病毒的生物樣品保存方法及試劑盒，可以使用直接擴(kuò)增技術(shù)廣 泛應(yīng)用于法醫(yī)市場(chǎng)DNA分析。同時(shí)由于本發(fā)明含有顏色指示劑的功能性溶液為密封保存， 保存時(shí)間不受保存條件的限制，因此可保證長期保存不發(fā)生褪色現(xiàn)象。
[0013] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0014] -種保存生物樣品的方法及試劑盒，將吸附有生物樣品的采集工具與功能性溶液 充分混合，將混合后生物樣品轉(zhuǎn)印至濾紙卡上保存；所述功能性溶液包括緩沖溶液、絡(luò)合 劑、抗菌劑、顏色指示劑和抗氧化劑。
[0015] 優(yōu)選的，所述緩沖溶液為pH6~10的緩沖溶液。
[0016] 優(yōu)選的，所述絡(luò)合劑為氨基羧酸鹽、羥基羧酸鹽、有機(jī)膦酸鹽或聚丙烯酸類絡(luò)合劑 等。
[0017] 優(yōu)選的，所述抗菌劑為陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性離子型表面活 性劑、非離子型表面活性劑、烷基胍表面活性劑、抗生素、防腐劑、EDTA等。
[0018] 優(yōu)選的，所述顏色指示劑為有色染料、氧化還原指示劑、金屬指示劑、鈣指示劑、天 然pH指示劑、生物指示劑等。
[0019] 優(yōu)選的，所述抗氧化劑為丁基羥基茴香醚（BHA)、二丁基羥基甲苯（BHT)、沒食子 酸丙酯（PG)、混合生育酚濃縮物及愈創(chuàng)樹脂、抗壞血酸及其鈉鹽、異抗壞血酸及其鈉鹽、硫 辛酸、維生素E，類胡蘿卜素、枸櫞酸、EDTA、磷酸衍生物、甲基硅酮、亞硫酸及其鈉鹽。
[0020] 優(yōu)選的，所述樣品為人或動(dòng)物的生理/病理體液、細(xì)胞懸液；人或動(dòng)物機(jī)體組織提 取液或者組織勻漿；植物的生理/病理體液或者細(xì)胞懸液；細(xì)菌、真菌、質(zhì)粒、病毒、寄生蟲 等的提取液或者懸液；DNA或者RNA合成過程的中間體；化學(xué)或生化合成的DNA或者RNA的 混合物；其他任何可以提供液態(tài)遺傳物質(zhì)。
[0021] 優(yōu)選的，所述緩沖溶液濃度< 600mM;所述絡(luò)合劑濃度為< 60mM;所述抗菌劑濃度 彡120mg/mL;所述顏色指示劑濃度為彡1%;所述抗氧化劑濃度彡180mM。
[0022] 優(yōu)選的，所述緩沖溶液濃度為240mM-480mM;所述絡(luò)合劑濃度為10mM-30mM;所述 抗菌劑濃度為45mg/mL-90mg/mL;所述顏色指示劑濃度為0. 02% ;所述抗氧化劑濃度為 30mM-60mM〇
[0023]本發(fā)明還提供一種保存生物樣品的試劑盒，包括功能性溶液，所述功能性溶液包 括緩沖溶液、絡(luò)合劑、抗菌劑、顏色指示劑和抗氧化劑。
[0024] 優(yōu)選的，所述的試劑盒還包括濾紙卡和/或采集工具。
[0025] 優(yōu)選的，所述的濾紙卡為普通濾紙卡。
[0026] 優(yōu)選的，所述采集工具為醫(yī)用采集工具。
[0027] 本發(fā)明提供了一種保存生物樣品的方法，使用采集工具采集生物樣品，之后將吸 附有生物樣品的采集工具置于功能性溶液中充分混合，最后將混合后生物樣品轉(zhuǎn)印至濾紙 卡上保存，其中所述功能性溶液包括緩沖溶液、絡(luò)合劑、抗菌劑、顏色指示劑、抗氧化劑。與 現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述保存生物樣品的方法，采集的生物樣品經(jīng)過一步混合操作，再轉(zhuǎn) 印至普通濾紙卡上，即可達(dá)到快速安全有效的保存生物樣品中遺傳物質(zhì)的目的，無需使用 制作成本高、價(jià)格昂貴的FTA卡，并具有操作簡便、樣品轉(zhuǎn)移效率高、能更有效殺滅細(xì)菌、病 毒的特點(diǎn)。本發(fā)明所述功能性溶液能夠與生物樣品中的細(xì)胞發(fā)生作用，抗菌劑使細(xì)胞膜破 裂、細(xì)胞核裂解，從而釋放出細(xì)胞核中的核酸，還能夠保證各類核酸長期保存，同時(shí)具有滅 菌作用，能夠及時(shí)殺滅生物樣品中可能存在的病原微生物，從而保證操作人員的安全性。此 外本發(fā)明含有顏色指示劑的功能性溶液為密封保存，保存時(shí)間不受保存條件的限制，因此 可保證長期保存不發(fā)生褪色現(xiàn)象。
[0028] 本發(fā)明所述試劑盒不含有毒試劑、適用范圍廣，保存各類生物樣品的效果優(yōu)于市 場(chǎng)上的大部分保存卡，而且成本低，適用于廣大的實(shí)驗(yàn)室和科研工作。
【附圖說明】
[0029] 圖1示熒光定量PCR擴(kuò)增圖，其中