)樣品置于55°C恒溫箱中孵育過夜，至管中無組織塊為止；
[0047] (4)加入Tris飽和酌? 800uL，輕微混勻lOmin，4°C12000r/min離心 12min;
[0048] (5)取65〇1^上清加1^8飽和酚：氯仿 ：異戊醇（25:24:1)80〇1^，混搖1〇1^11， 4°C12000r/min離心 12min;
[0049] (6)取 550uL上清，加氯仿 800uL，混搖lOmin，4°C12000r/min離心 12min;
[0050] 以下步驟換1. 5ml的離心管
[0051] (7)取 450iiL上清，加無水乙醇 800iiL，3M乙酸鈉 40iiL，混搖 6min，4°ClOOOr/ min離心 8min;
[0052] (8)棄上清留下DNA沉淀團，加入1000iiL70 %乙醇（自己配備），混搖5min, 4°C1000r/min離心5min,棄上清（如需要可重復一次）；
[0053](9)將離心管放入通風櫥，吹干至管內(nèi)無小滴；
[0054] (10)樣品加100UL超純水，輕微吹打至DNA溶解，經(jīng)過Nanodrop- 100分光光度 計檢測質(zhì)量與濃度后將濃度同一稀釋到50ng/i!L于-20°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0055] 3、豬全基因組6萬個（60K)SNP基因型檢測
[0056] 上述個體的DNA在Illumina Beadstation平臺上根據(jù)公司標準流程進行豬全基 因組60KSNP(Illumina，美國）基因型判定。利用PLINK(1.9)對所有樣本60K芯片數(shù)據(jù)進 行質(zhì)量控制，剔除檢出率低于〇. 95、家系孟德爾錯誤率高于0. 05的個體；最小等位基因頻 率小于0. 05的SNP標記。
[0057] 4、高產(chǎn)和相對低產(chǎn)群體Fst值的計算
[0058] 使用Powermarker軟件包對對分型個體的60K SNP標記型數(shù)據(jù)進行處理，計算得 到兩個群體的每一個SNP位點遺傳分化系數(shù)Fst值。結(jié)果顯示，F(xiàn)st值最高點位于豬X染 色體上，該SNP標記極有可能與總產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)（圖1)。
[0059] 實施例2
[0060] 本實施例為實施例1中得到的SNP位點g. 116527064T/C在二花臉母豬群體內(nèi)的 驗證。
[0061] 1、提取-花臉母豬基因組DNA
[0062] 采集具有準確窩總產(chǎn)仔數(shù)記錄的196頭純種二花臉母豬的耳組織樣品，放置于裝 有70%酒精的離心管內(nèi)，-20°C冰箱保存?zhèn)溆?。利用上述方法提取耳組織基因組DNA，經(jīng)過 質(zhì)量、濃度檢測后將濃度稀釋到30ng/i!L于-20°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0063] 2、目的片段PCR擴增與測序
[0064] 用已提取的DNA為模板，根據(jù)所設(shè)計的引物，進行PCR擴增：取DNA模板2. 5yL、 SEQIDNO:2 和SEQIDNO:3 所示的引物各 1. 25iiL、PCRMix試劑 25iiL、雙蒸水 20iiL; 設(shè)置PCR擴增體系：預變性96°C2min;變性96°C20s;退火65°C30s;延伸72°C45s;35個 循環(huán)；然后延伸l〇min。
[0065]PCR產(chǎn)物在1. 2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，擴增的目的片段大小為999bp，電泳圖 見圖2,將剩余的擴增產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果用DNAman軟件與GenBank中豬的相關(guān)基因片 段序列比對、分析，判讀g. 116527064T/C的基因型，然后利用SAS軟件進行基因型對表型的 影響效應(yīng)分析。分析模型為Yijklm=u+Gj+Bk+Pi+e^h
[0066] 其中：￥咖為豬的產(chǎn)仔數(shù)；G』代表第j個SNP的基因型固定效應(yīng)；Bk是第k個批次 固定效應(yīng)是胎次的隨機效應(yīng)，不同胎次的產(chǎn)仔數(shù)記錄作為重復數(shù)據(jù)處理；eijklm為殘差。
[0067] 顯著性的P值經(jīng)過10000次的隨機抽樣校正。
[0068] 表1給出了g. 116527064T/C突變位點在純種二花臉群體中對窩總產(chǎn)仔數(shù)的影響 效應(yīng)。由表1可知，純種二花臉豬中，g. 116527064T/C位點的CC基因型個體與TT型個體相 比較：窩總產(chǎn)仔數(shù)平均增加1. 12頭。由此可見，在二花臉豬種中，繼代選育g. 116527064T/ C位點的CC型個體，均可逐步提_二花臉母豬的窩總廣仔數(shù)，達到提_ -花臉母豬繁殖性 能的目的。
[0069] 表1、g. 116527064T/CSNP位點與二花臉母豬窩總產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析
[0070]
【主權(quán)項】
1. 一種與二花臉母豬產(chǎn)仔性狀相關(guān)的SNP標記，其特征在于所述SNP標記的位點為國 際豬基因組10. 2版本參考序列豬X染色體上g. 116527064核苷酸位點，且其為T/C突變， 所述SNP標記與二花臉母豬窩產(chǎn)總仔數(shù)極顯著相關(guān)。
2. -種基于權(quán)利要求1所述的SNP開發(fā)分子標記的方法，其特征在于以含有權(quán)利要求 1所述的SNP標記的核苷酸序列為基礎(chǔ)序列，設(shè)計引物對，以二花臉母豬基因組DNA為模板 進行PCR擴增，使權(quán)利要求1所述的SNP標記轉(zhuǎn)化為分子標記。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的引物對序列為上游引物：SEQ ID NO :2,下游引物：SEQ ID NO :3;所述的分子標記序列如SEQ ID NO :1所示，所述的SNP位點 位于第894位，存在T/C多態(tài)性。
4. 按照權(quán)利要求2或3所述的方法得到的分子標記。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的分子標記，其特征在于分子標記序列如SEQ ID NO: 1所示， 所述的SNP位點位于第894位，存在T/C多態(tài)性。
6. -種用于檢測權(quán)利要求1所述的SNP標記的引物對，其特征在于上游引物為：SEQ ID NO :2,下游引物為：SEQ ID NO :3。
7. -種檢測權(quán)利要求1所述的SNP標記的方法，其特征在于包含PCR擴增二花臉母豬 基因組中含有權(quán)利要求1所述的SNP標記的一段序列，對擴增產(chǎn)物進行測序，判讀該位點的 T/C多態(tài)性。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 取一頭二花臉母豬的耳組織樣品并提取總DNA ; (2) 用已提取的二花臉母豬基因組DNA為模板，使用權(quán)利要求5所述的引物進行PCR擴 增； (3) 擴增產(chǎn)物進行測序，分析測序結(jié)果，判讀在SEQ ID NO :1第894位的T/C多態(tài)性。
9. 權(quán)利要求1所述的SNP標記、權(quán)利要求4或5所述的分子標記、權(quán)利要求6所述的引 物在篩選高產(chǎn)二花臉母豬品系中的應(yīng)用。
10. -種篩選高產(chǎn)二花臉母豬品系的方法，其特征在于包括檢測二花臉母豬 g. 116527064核苷酸位點的基因型，選育g. 116527064核苷酸位點的CC型個體作為種豬。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與二花臉母豬產(chǎn)仔性狀相關(guān)的SNP標記及其應(yīng)用。一種與二花臉母豬產(chǎn)仔性狀相關(guān)的SNP標記，所述SNP標記的位點為國際豬基因組10.2版本參考序列豬X染色體上g.116527064核苷酸位點，且其為T/C突變，所述SNP標記與二花臉母豬窩產(chǎn)總仔數(shù)極顯著相關(guān)。一種用于檢測權(quán)利要求1所述的SNP標記的引物對，上游引物為：SEQ ID NO：2，下游引物為：SEQ ID NO：3。本發(fā)明提供的SNP標記與二花臉母豬的產(chǎn)仔性能相關(guān)，因此，可以通過鑒定該SNP標記來篩選高產(chǎn)的二花臉母豬品系，所得的二花臉母豬高產(chǎn)品系具有重要的經(jīng)濟效益與社會價值。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104651526
【申請?zhí)枴緾N201510115172
【發(fā)明人】黃瑞華, 方宇瑜, 汪涵, 李平華, 郝帥帥
【申請人】南京農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年3月16日