用于新城疫病毒檢測(cè)的納米pcr試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及新城疫病毒的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 新城疫（Newcastle disease，ND)也稱為亞洲雞瘟或雞瘟，是由新城疫病毒 (Newcastle Disease Virus，NDV)引起的一種急性高度接觸性傳染病。本病分布于世界各 地，是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疾病之一，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（0IE)將新城疫列為A類動(dòng)物疫 病，我國(guó)政府將其列為一類動(dòng)物疫病。
[0003]NDV的檢測(cè)方法主要包括傳統(tǒng)的病毒的分離、血凝與血凝抑制試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散、聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)等，這些方法在病毒檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用。其中PCR檢測(cè)方法由于 操作簡(jiǎn)單，靈敏性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。但在實(shí)際應(yīng)用中，PCR技術(shù)存在諸多局 限性，例如對(duì)復(fù)雜體系的擴(kuò)增會(huì)出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增以及擴(kuò)增效率不夠高等問題。為解 決以上問題，尋找可以提高PCR特異性和效率的添加劑顯得極其重要。
[0004] 納米PCR技術(shù)是一種新型的PCR技術(shù)，其原理是把粒徑為lnm~100nm的固相納 米金屬顆粒懸浮在液體中形成納米流體。由于納米材料具有良好的熱傳導(dǎo)性，因此在添加 了納米金顆粒的PCR循環(huán)體系中，PCR反應(yīng)會(huì)更快地達(dá)到目標(biāo)溫度，減少了在非目標(biāo)溫度的 停留時(shí)間，進(jìn)而縮短整個(gè)體系達(dá)到溫度平衡所用的時(shí)間，減少非特性擴(kuò)增，提高特異性擴(kuò)增 產(chǎn)量。因此，目前亟需建立一種能夠快速、特異的檢測(cè)新城疫病毒的納米PCR檢測(cè)手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種用于新城疫病毒檢測(cè)的納米PCR試 劑盒及其應(yīng)用，該試劑盒能夠快速、特異的檢測(cè)新城疫病毒。
[0006] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種用于新城疫病毒檢測(cè)的納米PCR試劑盒，包括 5X反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTPMixture、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑和反轉(zhuǎn)錄引物，其特征在于所述 試劑盒還包括2XNanoPCRMix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列為SEQIDNo. 1 所示，所述下游引物的序列為SEQIDNo. 2所示。
[0007] 引物是根據(jù)GenBank公布的新城疫病毒序列，在其M基因保守序列區(qū)域設(shè)計(jì)的一 對(duì)特異性引物。
[0008]優(yōu)選的，2XNanoPCR Mix由DNA聚合酶、2XNanoPCR buffer和dNTP Mixture組 成。
[0009] 優(yōu)選的，反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。
[0010] 優(yōu)選的，反轉(zhuǎn)錄引物的序列為SEQIDNo. 3所示。
[0011] 優(yōu)選的，所述試劑盒還包括RNA提取試劑：TRIzolLSReagent、氯仿、異丙醇、75% 乙醇。
[0012] 優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照。
[0013] 其中，陽(yáng)性對(duì)照可為將新城疫病毒接種雞胚后，收集72~96小時(shí)死亡雞胚的尿囊 液。
[0014] 本發(fā)明還提出了所述的試劑盒在制備檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有新城疫病毒的產(chǎn) 品中的應(yīng)用。
[0015] 應(yīng)用所述試劑盒檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有新城疫病毒的方法，包括如下步驟： 1、病毒RNA的提取 (1)將250yL經(jīng)過預(yù)處理的待測(cè)樣品加入750yLTRIzolLSRegent中，劇烈振蕩 2min，室溫放置5min。加入250iiL氯仿，劇烈振蕩lmin，室溫放置5min后，4°C12,000 rpm離心15min，將上層水相轉(zhuǎn)入新的離心管。（2)加入與水相等體積的異丙醇，混勻，室溫 靜置15min, 4°C12, 000rpm離心15min,輕輕倒去上清，然后加入DEPC處理的75%乙醇 700~800111，41：12,000卬111離心5 111111，棄上清。（3)將沉淀自然風(fēng)干或于501：干燥箱 中晾干，用適量無(wú)核酸酶水充分溶解后立即進(jìn)行RT-LAMP或貯存于-80°C備用。
[0016] 待測(cè)樣品可為雞、鴨與鵝的腺胃、盲腸扁桃體、脾臟或咽喉拭子等組織。其中，待測(cè) 樣品預(yù)處理的方法為：將待測(cè)樣品剪碎后，按照1:5的質(zhì)量體積比加入生理鹽水并研磨均 勻，3000~5000rpm離心5~10分鐘后取上清，之后再進(jìn)行RNA的提取。若待測(cè)樣品為咽 喉拭子可直接提取RNA。
[0017] 2、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取上述步驟所得的病毒總RNA11iiL，加入2iiL10剛的反轉(zhuǎn)錄引物（SEQIDNo. 3)， 4UL5X反轉(zhuǎn)錄緩沖液、0. 5iiL反轉(zhuǎn)錄酶、0. 5iiLRNA酶抑制劑、2iiLdNTPMixture 至20iiL，42°C水浴1~2h，即得到cDNA溶液。
[0018] 3、納米PCR反應(yīng) 在反應(yīng)管中加入10yL2XNanoPCRMix、lilL上述cDNA溶液、0.5ilLlO剛的上游 引物（SEQIDNo. 1)、0. 5iiL10MM的下游引物（SEQIDNo. 2)，最后加入無(wú)核酸酶水至總 體積為20uL。
[0019] 混勻后按如下反應(yīng)程序進(jìn)行：94°C3min，l個(gè)循環(huán)；94°C10s，56°C30s，72°C 15s，共30個(gè)循環(huán)；72°C5min1個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物，若出現(xiàn)297bp大小的條帶則待測(cè)樣品含有新城疫病毒。
[0020] 本發(fā)明提供了一對(duì)檢測(cè)新城疫病毒的特異性引物，利用其制成的納米PCR試劑 盒，能夠快速、特異的檢測(cè)新城疫病毒。本發(fā)明可使PCR反應(yīng)更快地達(dá)到目標(biāo)溫度，減少了 在非目標(biāo)溫度的停留時(shí)間，進(jìn)而縮短整個(gè)體系達(dá)到溫度平衡所用的時(shí)間，大大提高了新城 疫病毒的檢測(cè)效率，并有效提高了新城疫病毒的特異性擴(kuò)增產(chǎn)量，減少了非特異性擴(kuò)增，具 有很好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為新城疫病毒納米PCR檢測(cè)結(jié)果； M:DL2000Marker; 1 :陽(yáng)性對(duì)照； 圖2為新城疫病毒納米PCR敏感性檢測(cè)結(jié)果； M:DL2000Marker;1:新城疫病毒；2:禽流感病毒；3:傳染性法氏囊病毒；4 :傳染性 支氣管炎病毒；5 :鴨瘟病毒；6 :陰性對(duì)照； 圖3為新城疫病毒納米PCR特異性檢測(cè)結(jié)果。
[0022] M:DL2000Marker;1~6依次為10°~1(T5倍比稀釋病毒核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物；7:陰 性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面參照附圖并結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。但是本發(fā)明不限于所 給出的例子。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例 中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0024] 實(shí)施例1一種檢測(cè)新城疫病毒的納米PCR試劑盒最佳實(shí)施例 本實(shí)施例試劑盒包括：（1)新城疫病毒RNA提取試劑：TRIzolLSReagent、氯仿、異丙 醇、75%乙醇；（2)反轉(zhuǎn)錄試劑：5X反轉(zhuǎn)錄緩沖液、濃度為2. 5mM的dNTPMixture、濃度為 2. 5U/yL的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、濃度為30U/yL的RNA酶抑制劑和反轉(zhuǎn)錄引物；（3)納米 PCR反應(yīng)試劑：2XNanoPCRMix、上游引物、下游引物；（4)其他：陽(yáng)性對(duì)照和無(wú)核酸酶水。 其中，2XNanoPCRMix由DNA聚合酶、2XNanoPCRbuffer和dNTPMixture組成，陽(yáng)性對(duì)照 為將新城疫病毒接種雞胚后，72~96小時(shí)死亡雞胚的尿囊液，引物為凍干粉，HPLC純。本 實(shí)施例試劑盒包含的引物序列見表1。
[0025] 表1引物序列
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于新城疫病毒檢測(cè)的納米PCR試劑盒，包括5X反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP Mixture、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑和反轉(zhuǎn)錄引物，其特征在于所述試劑盒還包括2 X NanoPCR Mix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列為SEQ ID No. 1所示，所述下游引物的序列 為 SEQ ID No. 2 所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于新城疫病毒檢測(cè)的納米PCR試劑盒，其特征在于所述 2XNanoPCR Mix 由 DNA 聚合酶、2XNanoPCR buffer 和 dNTP Mixture 組成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于新城疫病毒檢測(cè)的納米PCR試劑盒，其特征在于所述反 轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于新城疫病毒檢測(cè)的納米PCR試劑盒，其特征在于所述反 轉(zhuǎn)錄引物的序列為SEQ ID No. 3所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于新城疫病毒檢測(cè)的納米PCR試劑盒，其特征在于所述試 劑盒還包括RNA提取試劑：TRIzol LS Reagent、氯仿、異丙醇、75%乙醇。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于新城疫病毒檢測(cè)的納米PCR試劑盒，其特征在于所述試 劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照。
7. 如權(quán)利要求1~6任一項(xiàng)所述的試劑盒在制備檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有新城疫病 毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于新城疫病毒檢測(cè)的納米PCR試劑盒及其應(yīng)用。所述試劑盒包括5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP Mixture、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑和反轉(zhuǎn)錄引物，其特征在于所述試劑盒還包括2×NanoPCR Mix、上游引物和下游引物，其中，上游引物的序列為SEQ ID No.1所示，下游引物的序列為SEQ ID No.2所示。該試劑盒可用于檢測(cè)新城疫病毒。本發(fā)明還提供了一種采用前述試劑盒進(jìn)行新城疫病毒檢測(cè)的方法，能夠快速、特異的檢測(cè)新城疫病毒，大大提高了新城疫病毒的檢測(cè)效率及新城疫病毒的特異性擴(kuò)增產(chǎn)量。
【IPC分類】C12R1-93, C12Q1-70, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104651532
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510077655
【發(fā)明人】袁萬(wàn)哲, 劉聚祥, 孫繼國(guó), 陳立功, 劉靜, 王庚南
【申請(qǐng)人】河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2015年2月13日