一種豬圓環(huán)病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體說是涉及一種快速、可視化并且可實(shí)時定 量檢測豬圓環(huán)病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 圓環(huán)病毒（PCV)屬于圓環(huán)病毒科，是目前已知脊椎動物病毒中最小的一種。豬是圓 環(huán)病毒的主要宿主，各種年齡的豬對圓環(huán)病毒均有較強(qiáng)易感性。胚胎期或生后早期感染的 豬，往往在斷奶后才發(fā)病，一般集中在5周齡~18周齡，尤其在6周齡~12周齡最多見。懷 孕母豬感染圓環(huán)病毒后，導(dǎo)致繁殖障礙，并可經(jīng)胎盤垂直傳染給仔豬。感染豬可自鼻液、糞 便等排泄物中排出病毒，經(jīng)消化道、呼吸道引起感染。
[0004] 以圓環(huán)病毒II型（PCV-2)為主要病原，并與豬細(xì)小病毒（PPC)或與豬繁殖、呼吸 綜合征病毒（PRRSV)等病原共同感染而引起的一種新的傳染病一一斷奶仔豬衰竭綜合征， 近年來，已在世界各地發(fā)生；此外圓環(huán)病毒可引起豬皮炎與腎病綜合征，該病發(fā)病率可達(dá) 14%，病死率可高達(dá)30% ;可引起增生性壞死性間質(zhì)性肺炎，該病發(fā)病率為2% ~30%，病死 率為4% ~10% ;還可造成繁殖障礙，導(dǎo)致母豬發(fā)情率增加、產(chǎn)木乃伊胎、流產(chǎn)以及死產(chǎn)和產(chǎn) 弱仔等，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重威脅和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0005] 對圓環(huán)病毒的快速準(zhǔn)確診斷是臨床上防治豬圓環(huán)病毒的關(guān)鍵。目前實(shí)驗(yàn)室診斷 PCV的方法大致可分為2類：①病毒的分離與鑒定；②分子生物學(xué)方法。病毒分離與鑒定具 有結(jié)果準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)，多用于急性病例的確診和新疫區(qū)的確定，但此方法需要多次操作 程序，影響因素較多，且費(fèi)時費(fèi)力，不適于此病的快速診斷。分子生物學(xué)方法包括PCR、定量 PCR、套式PCR，雖然PCR方法較病毒分離鑒定方法快速準(zhǔn)確，但需要昂貴的儀器設(shè)備，成本 較高，在結(jié)果判定上需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，容易造成實(shí)驗(yàn)室污染導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性結(jié)果， 也不適合基層和現(xiàn)場檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了解決基層檢測豬圓環(huán)病毒困難、耗時長和儀器昂貴等問題， 提供一種為基層簡便、快捷準(zhǔn)確地檢測豬圓環(huán)病毒的試劑盒，為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的 技術(shù)方案為：一種豬圓環(huán)病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑盒，該試劑盒包括LAMP引物、2X反應(yīng)緩 沖液、BstDNA聚合酶、熒光目視檢測試劑、超純水和豬圓環(huán)病毒DNA模板；所述的LAMP引 物包括外引物F3(SEQIDNO:l)與B3(SEQIDNO:2)、內(nèi)引物FIP(SEQIDNO:3)與BIP (SEQIDN0:4)和環(huán)引物L(fēng)F(SEQIDNO:5)與LB(SEQIDNO:6); 其中： F3GGGAGTCTGGTGACCGTT B3CCATCCCACCACTTGTTTCT FIPACGCTTCTGCATTTTCCCGCTCGAGCAGCACCCTGTAACG BIPCACGTCATTGTGGGGCCACCTTCCAGTATGTGGTTTCCGG LFTTCAAAAGTTCAGCCAGCCC LBTGTGGTAAAAGCAAATGGGCT； 所述的 2X反應(yīng)緩沖液是Tris_HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine和dNTPs〇
[0007] 以上所述的豬圓環(huán)病毒DNA模板提取自豬圓環(huán)病毒培養(yǎng)物，是使用病毒基因組 DNA/RNA提取試劑盒提取。
[0008] 以上所述的熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素?zé)晒庠噭瑹晒庠噭┰诜磻?yīng)前加入。
[0009]以上所述的 2X反應(yīng)緩沖液包括Tris-HCL35-55mM、KCL10-30mM、MgS04 15-28mM、（NH4)2S04 18-28mM、Tween20 0? 5-1. 5%、Betaine1. 3-3. 5M和dNTPs 2. 4-4. 8mM，其配制方法在pH為8. 6條件下，將上述溶劑混合均勻獲得。
[0010] 一種豬圓環(huán)病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑盒的應(yīng)用，于獸醫(yī)臨床上檢測疑似豬圓環(huán)病 變組織是否含有豬圓環(huán)病毒，具體檢測步驟包括： (1) LAMP引物的設(shè)計與合成 (2) 檢測豬圓環(huán)病毒DNA模板的提取 (3) LAMP反應(yīng)體系建立 (4) LAMP檢測方法。
[0011] 以上所述的LAMP反應(yīng)體系建立以25yl計， 2X反應(yīng)緩沖液 12. 5yL BstDNA聚合酶 1 yL FIP 40pmol BIP 40pmol F3 5pmol B3 5pmol 豬圓環(huán)病毒DNA 2yL 超純水 補(bǔ)足25yL。
[0012] 以上所述的LAMP檢測方法是采用特異性檢測、敏感性檢測和熒光可視化檢測的 方法。
[0013] 以上所述的LAMP檢測方法采用LoopampLA-320C實(shí)時濁度儀進(jìn)行密閉全程監(jiān)控， 反應(yīng)溫度為63 °C、反應(yīng)在20-30分鐘間出現(xiàn)擴(kuò)增。
[0014] 本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和進(jìn)步是： 1)特異性強(qiáng) 所檢測的陰性對照病毒和水對照均無陽性結(jié)果出來，與PCR檢測結(jié)果一致。且操作簡 便、快速獲得檢測結(jié)果、無需昂貴復(fù)雜的儀器。
[0015] 2)靈敏度高 普通PCR檢測方法的靈敏度為1. 274X1CT2ng/yL，而使用本發(fā)明的LAMP檢測方法，檢 測限約為1.274父10_31^/1^，是普通？0?的10倍。
[0016] 3)迅速獲得結(jié)果 普通的PCR整個過程在24小時左右才能得出結(jié)果，目前多數(shù)建立的LAMP反應(yīng)方法在 反應(yīng)結(jié)束后，須采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像來判定結(jié)果，從病毒基因組DNA提取 到獲取試驗(yàn)結(jié)果，需要4-5小時左右。本發(fā)明提供的LAMP檢測方法反應(yīng)在25分鐘左右出 現(xiàn)擴(kuò)增，60分鐘內(nèi)即可完成擴(kuò)增，且結(jié)果判讀方式簡便，依據(jù)反應(yīng)管濁度值的變化情況即可 判斷結(jié)果，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束即可獲得試驗(yàn)結(jié)果，不需要再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯 像來判定結(jié)果，從基因組DNA提取到獲得最終結(jié)果可在2-3小時內(nèi)完成。
[0017] 4)不造成污染 目前LAMP方法用于直接觀察的熒光染料為反應(yīng)后加入，而本發(fā)明的熒光染料是在反 應(yīng)前加入的鈣黃綠素商用染料(非syber-green)，檢測過程不需要開蓋。此外，本發(fā)明的 LAMP檢測方法在結(jié)果判定上，直接通過濁度儀檢測反應(yīng)管的濁度值來判定結(jié)果，可不進(jìn)行 熒光染料法檢測結(jié)果或者進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，不需要開蓋，能有效避免污染。
[0018] 5)可實(shí)時定量 本發(fā)明利用Tubidimeterreal-timeLA-320池度儀來實(shí)時分析LAMP反應(yīng)的結(jié)果，不 同的標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度對應(yīng)的濁度值的時間繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可求 出各時間的豬圓環(huán)病毒2型拷貝數(shù)，達(dá)到定量檢測產(chǎn)物的目的。
【附圖說明】
[0019] 圖1是本發(fā)明的LAMP方法特異性檢測結(jié)果，其中1 :豬圓環(huán)病毒2型；2:細(xì)小病 毒；3 :偽狂犬病毒；4 :豬瘟病毒；5 :藍(lán)耳病病毒；6 : 口蹄疫病毒；7 :傳染性胃腸炎病毒；8 : 流行性腹瀉病毒；9 :空白對照(水)。豬圓環(huán)病毒2型反應(yīng)管出現(xiàn)濁度的上升曲線，7株對照 病毒反應(yīng)管和水對照反應(yīng)管均無擴(kuò)增。
[0020] 圖2和圖3是分別使用本發(fā)明LAMP方法和普通PCR方法進(jìn)行的豬圓環(huán)病毒2型敏 感性檢測的結(jié)果。其中 1 :1. 27X102ng/yL;2 :1. 27X101ng/yL;3 :1. 27X10°ng/yL;4 : 1. 27X10_1ng/yL； 5 :1. 27Xl(T2ng/yL;6 :1. 27Xl(T3ng/yL;7 :1. 27Xl(T4ng/yL;8 : 1. 27Xl(T5ng/yL;9 :1. 27X1(T6ng/yL;10 :1. 27X1(T7ng/yL;11 :1. 27X1(T8ng/yL; 12 :水。豬圓環(huán)病毒2型基因組DNA的起始濃度為1. 27X102ng/yL，經(jīng)10倍倍比連續(xù)稀 釋后，進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示本發(fā)明的LAMP法檢測限約為1. 27X1(T3ng/yL，而 普通PCR方法檢測限約為1. 27Xl(T2ng/yL。
[0021] 圖4是加入熒光染料后肉眼觀察結(jié)果：左管為以豬圓環(huán)病毒2型基因組DNA為模 板的反應(yīng)情況，為陽性結(jié)果，右管為陰性對照的反應(yīng)情況，為陰性結(jié)果。
[0022] 圖5是本發(fā)明豬圓環(huán)病毒2型定量標(biāo)準(zhǔn)曲線：利用不同的標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度對應(yīng)的 濁度值對時間繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可求出各時間的豬圓環(huán)病毒2型 拷貝數(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 1、材料的準(zhǔn)備 豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、藍(lán)耳病病毒、口蹄疫病毒、偽狂犬病毒、傳染性胃腸炎病 毒、流行性腹瀉病毒、細(xì)小病毒，均為市售疫苗。LAMPDNA擴(kuò)增試劑盒購自北京藍(lán)譜生物科 技有限公司，貨號LMP204 ;病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，購自康為世紀(jì)生物科技有限公 司，貨號CW0548。
[0024] 2、LAMP引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中的圓環(huán)病毒2型Rep基因序列，利用LAMP法引物輔助設(shè)計軟件PrimerExplorerV4軟件設(shè)計一套LAMP引物，其中F3、B3為外引物，F(xiàn)IP、BIP為內(nèi)引物， LF和LB為環(huán)引物，其中 F3GGGAGTCTGGTGACCGTT B3CCATCCCACCACTTGTTTCT FIPACGCTTCTGCATTTTCCCGCTCGAGCAGCACCCTGTAACG BIPCACGTCATTGTGGGGCCACCTTCCAGTATGTGGTTTCCGG LFTTCAAAAGTTCAGCCAGCCC LBTGTGGTAAAAGCAAATGGGCT 3、病毒基因組DNA提取 使用病毒基因組DNA