一種豬瘟病毒逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體說是涉及一種快速、可視化并且可實時定 量檢測豬瘟病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]豬癌（Swinefever,Hogcholera)又名豬霍亂（HogCholera，HC)，我國俗稱爛腸 癌。歐洲為了區(qū)別于非洲豬癌稱其為古典豬癌（Classicalswinefever，CSF)。其病原是 豬癌病毒（Hogcholeravirus，HCV或Classicalswinefevervirus，CSFV)，該病是豬的 一種接觸性烈性傳染病，臨床以稽留高燒，皮膚和粘膜出現(xiàn)大量出血點為特征。豬瘟被世界 動物衛(wèi)生組織（0IE)列入A類疫病名錄，為須申報的動物傳染病，我國也將其列為一類動物 傳染病。該病于1833年首先發(fā)現(xiàn)于美國的俄亥俄州，全世界大多數(shù)養(yǎng)豬國家都存在，給 養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。盡管世界各養(yǎng)豬大國對豬瘟病毒給予了足夠的重視，但是 由于參差不齊的疫苗質(zhì)量，不合理的免疫程序以及野豬群中攜帶的豬瘟病毒等因素，致使 豬瘟目前仍是威脅各國養(yǎng)豬業(yè)的一個極重要的傳染病，常常突然爆發(fā)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損 失。每年用于預(yù)防接種、治療、撲殺的費用數(shù)以億計，我國也是一個受豬瘟危害較為嚴(yán)重的 國家。據(jù)統(tǒng)計，近幾年來，因各種疾病死亡的牲豬占飼養(yǎng)總數(shù)（1998年達(dá)8億頭）的8%~ 10%，其中約1/3由豬瘟致死，每年的經(jīng)濟(jì)損失在10億元左右。因其影響畜產(chǎn)品的貿(mào)易所 造成的間接損失更是不可估量。因此長期以來，豬瘟一直是獸醫(yī)疫病研究的重點和熱點之 〇
[0004] 豬瘟是危害我國豬生產(chǎn)的重要疫病，對豬瘟密切監(jiān)測和快速診斷，有利于該病的 防治。目前，豬瘟病毒的檢測技術(shù)主要有常規(guī)方法和分子生物學(xué)方法。常規(guī)方法是病毒的 分離鑒定，其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但常規(guī)鑒定方法存在操作復(fù)雜，需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，所需時 間長的缺點，不利于豬瘟的快速診斷。分子生物學(xué)的方法是通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (RT-PCR)方法檢測豬瘟病毒的特異性基因，雖然RT-PCR方法較常規(guī)方法快速準(zhǔn)確，但需要 設(shè)計特異性強的引物和昂貴的儀器設(shè)備，成本較高，在結(jié)果判定上需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電 泳，容易造成實驗室污染導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性結(jié)果，也不適合基層和現(xiàn)場檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種為基層快速、準(zhǔn)確并且實時檢測豬瘟病毒的方法，提供 一種快速、可視化并且可實時定量檢測豬瘟病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒。為實現(xiàn) 本發(fā)明目的所使用的技術(shù)方案為： 一種豬瘟病毒逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒，該試劑盒包括RT-LAMP引物、2X反應(yīng)緩 沖液、EM、熒光目視檢測試劑、超純水和豬瘟病毒RNA模板，所述的RT-LAMP引物包括外引物 F3(SEQIDN0:1)與B3(SEQIDN0:2)、內(nèi)引物FIP(SEQIDN0:3)與BIP(SEQIDN0: 4)和環(huán)引物L(fēng)F(SEQIDNO:5); 其中引物的序列分別為： F3CATGCCCAAGACACACCTTA B3CGTGGCATCGTATACCGG FIPCCTCTGCAGCACCCTATCAGGGGTCGCTAGGGTGAAATCAC BIPTGCTGTACATGGCACATGGAGTTCCTCCACTCCCATTGGTT LFCGTACTCCCATCACGTGGT； 所述的 2X反應(yīng)緩沖液包括Tris-HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine和dNTPs〇
[0006] 以上所述的豬瘟病毒RNA模板是使用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取的豬瘟 病毒RNA。
[0007] 以上所述的熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素?zé)晒庠噭?，熒光試劑在反?yīng)前加入。
[0008]以上所述的 2X反應(yīng)緩沖液包括Tris-HCL35-50mM、KCL15-35mM、MgS04 15-20mM、（NH4)2S04 15-25mM、Tween20 0? 4-0. 8%、Betaine1. 5-3. 0M和dNTPs2. 5-4mM， 其配制方法在pH為8. 7條件下，將上述溶劑混合均勻獲得。
[0009] -種豬瘟病毒逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒的應(yīng)用，用于檢測豬瘟病毒以及疑似 豬瘟病變組織是否感染豬瘟病毒，具體檢測步驟包括： (1) RT-LAMP引物的設(shè)計與合成 (2) 豬瘟病毒RNA模板的提取 (3) RT-LAMP反應(yīng)體系建立 (4)RT-LAMP檢測方法。
[0010] 以上所述的RT-LAMP反應(yīng)體系建立以25ill計， 2X反應(yīng)緩沖液 12. 5yL EM 1uL FIP 40 pmol BIP 40 pmol LF 25 pmol F3 5 pmol B3 5pmol 豬瘟病毒RNA 5uL 超純水 補足25yL。
[0011] 以上所述的RT-LAMP檢測方法是采用特異性檢測、敏感性檢測和熒光可視化檢測 的方法。
[0012] 以上所述的RT-LAMP檢測方法采用LoopampLA-320C實時濁度儀進(jìn)行密閉全程監(jiān) 控，反應(yīng)溫度為63°C、反應(yīng)在15-25分鐘間出現(xiàn)擴增。
[0013]本發(fā)明的實質(zhì)性特點和顯著的進(jìn)步是： 1)特異性強 本發(fā)明的RT-LAMP檢測方法特異性檢測出豬瘟病毒，而所檢測的陰性對照病毒、陰性 對照細(xì)菌和水對照均無陽性結(jié)果出來，與RT-PCR檢測結(jié)果一致。且操作簡便、快速獲得檢 測結(jié)果、無需昂貴復(fù)雜的儀器，普通RT-PCR法需先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（RT)，然后再以RT產(chǎn)物為模 板進(jìn)行PCR反應(yīng),使用了兩個反應(yīng)程序，而RT-LAMP方法可在一個反應(yīng)管內(nèi)同時完成兩個反 應(yīng)程序，一個小時即可完成擴增。
[0014] 2)靈敏度高 提取的豬瘟病毒RNA原始濃度為0. 8ng/yL，北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司生 產(chǎn)銷售豬瘟病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒的檢測限約為0. 8X1(T2ng/yL，而使用本發(fā)明 檢測方法，檢測限約為〇. 8X1(T3ng/yL，敏感性是瘟病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒提供的 RT-PCR方法的10倍。
[0015] 3)迅速獲得結(jié)果 普通的RT-PCR整個過程在24小時左右才能得出結(jié)果，目前多數(shù)建立的RT-LAMP反 應(yīng)方法在反應(yīng)結(jié)束后，須采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像來判定結(jié)果，從病毒基因組 DNA/RNA提取到獲取試驗結(jié)果，需要5-6小時左右。本發(fā)明提供的RT-LAMP檢測方法反應(yīng)在 20分鐘左右出現(xiàn)擴增，60分鐘內(nèi)即可完成擴增，且結(jié)果判讀方式簡便-依據(jù)反應(yīng)管濁度值 的變化情況即可判讀結(jié)果，擴增反應(yīng)結(jié)束即可獲得試驗結(jié)果，不需要再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電 泳紫外線顯像分析或者反應(yīng)結(jié)束后加入熒光染料來判讀結(jié)果，從病毒基因組DNA/RNA提取 到獲得最終結(jié)果可在2-3小時內(nèi)完成。
[0016] 4)不造成污染 目前RT-LAMP方法用于直接觀察的熒光染料為反應(yīng)后加入，而本發(fā)明的熒光染料是在 反應(yīng)前加入的鈣黃綠素商用染料(非syber-green)，檢測過程不需要開蓋，能有效避免實驗 環(huán)境的污染。此外，本發(fā)明的RT-LAMP檢測方法在結(jié)果判定上，直接通過濁度儀檢測反應(yīng)管 的濁度值來判定結(jié)果，可不進(jìn)行熒光染料法檢測結(jié)果或者進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果， 不需要開蓋，能有效避免污染。
[0017] 5)可實時定量 本發(fā)明利用Tubidimeterreal-timeLA-320C池度儀來實時分析RT-LAMP反應(yīng)的結(jié) 果，不同的標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度對應(yīng)的濁度值的時間繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即 可求出各時間的豬瘟病毒（CSFV)拷貝數(shù)，達(dá)到定量檢測產(chǎn)物的目的。
【附圖說明】
[0018] 圖1是本發(fā)明RT-LAMP方法特異性檢測結(jié)果；其中1 :豬瘟病毒兔化弱毒株；2 :豬 瘟病毒石門株；3 :豬瘟病毒野毒梧州株；4 :豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒；5 : 口蹄疫病 毒；6 :偽狂犬病毒；7 :傳染性胃腸炎病毒；8 :流行性腹瀉病毒；9 :細(xì)小病毒；10 :圓環(huán)病毒 2型；11 :大腸桿菌0157:H7 ;12 :2型鏈球菌；13 :副豬嗜血桿菌；14 :沙門氏菌；15 :隱秘桿 菌；16:水對照。3株豬瘟病毒反應(yīng)管出現(xiàn)濁度的上升曲線，7株對照病毒反應(yīng)管、5株對照 細(xì)菌反應(yīng)管和水對照反應(yīng)管均無擴增。
[0019] 圖2是使用本發(fā)明RT-LAMP方法進(jìn)行的豬瘟病毒敏感性檢測結(jié)果，圖3是使用北 京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)銷售的豬瘟病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒(貨號： CSF20140814P)進(jìn)行的豬瘟病毒敏感性檢測結(jié)果，其中1 :0. 8ng/iiL; 2 :0. 8XKT1ng/ iiL;3 :0? 8X1(T2ng/iiL;4 :0? 8X1(T3ng/iiL;5 :0? 8X1(T4ng/iiL;6 :0? 8X1(T5ng/iiL; 7 :0? 8X10_6ng/iiL;8 :0? 8X10_7ng/iiL;豬瘟病毒原始RNA的起始濃度為 0? 8ng/iiL，經(jīng) 10倍倍比連續(xù)稀釋后，進(jìn)行RT-LAMP和RT-PCR擴增，結(jié)果顯示本發(fā)明的RT-LAMP法檢測限 約為0. 8X10_3ng/iiL，而豬瘟病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒檢測限約為0. 8X10_2ng/iiL。
[0020] 圖4是加入熒光染料后肉眼觀察結(jié)果：左管為以豬瘟病毒基因組RNA為模板的反 應(yīng)情況，為陽性結(jié)果，右管為陰性對照的反應(yīng)情況，為陰性結(jié)果。
[0021] 圖5是本發(fā)明定量檢測豬瘟病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線：利用不同的標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度對應(yīng)的 濁度值對時間繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可求出各時間的豬瘟病毒拷貝數(shù)。
【具體實施方式】
[0022] 1、材料的準(zhǔn)備 豬瘟病毒（CSFV)包括(豬瘟兔化弱毒株、豬瘟病毒野毒石門株、豬瘟病毒野毒梧州株)， 對照毒株包括豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒、口蹄疫病毒、偽狂犬病毒、傳染性胃腸炎病 毒、流行性腹瀉病毒、細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型，對照細(xì)菌包括大腸桿菌、2型鏈球菌、副 豬嗜血桿菌、沙門氏菌、隱秘桿菌，為市售疫苗毒株，或為廣西獸醫(yī)研究所分離鑒定和保存。 LAMP法RNA擴增試劑盒購自北京藍(lán)譜生物科技有限公司，貨號SLP246,病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號CW0548。
[0023] 2、RT-LAMP引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中的豬瘟病毒編碼N蛋白的基因序列，利用RT-LAMP法引物輔助設(shè)計軟 件PrimerExplorerV4軟件設(shè)計一套RT-LAMP引物，其中F3、B