一種同時檢測水稻四種病毒的一步法多重pcr檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物病毒學領(lǐng)域，具體涉及一種同時檢測水稻四種病毒的一步法多重PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是我國主要的糧食作物之一，但病毒病的發(fā)生常影響其產(chǎn)量。病害嚴重時，可導(dǎo)致整個田塊失收，給農(nóng)業(yè)帶來了巨大損失。因此，對危害水稻的病原進行快速準確的檢測和診斷在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐上具有應(yīng)用意義。
[0003]水稻瘤矮病毒(Ricegall dwarf virus, RGDV)、水稻齒葉矮縮病毒(Rice raggedstunt virus, RRSV)、南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarfvirus, SRBSDV)和水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV )是四種常見的水稻病毒。其中SRBSDV引起的病害首次在廣東省陽江市發(fā)現(xiàn)，其主要分布在我國南部及越南北部地區(qū)，嚴重影響了水稻產(chǎn)量。目前所知，白背飛風(Sogatella furciferaHorvath)為其主要介體，并以持久性方式傳播病毒。水稻感染SRBSDV后，發(fā)病植株矮縮、葉片深綠、葉尖扭曲、莖桿上有白色瘤突等癥狀。RBSDV主要由灰飛虱(Laodelphaxsreiatellus Fallen)持久性傳播,能侵染水稻、玉米和小麥等糧食作物,其在水稻上的主要癥狀表現(xiàn)為植株矮縮、葉片濃綠僵直、發(fā)病初期葉脈上有白色條狀瘤突。RRSV以褐飛虱(Nilaparvata Iugens)為主要介體并作持久性傳播，感病水稻明顯矮縮、分蘗增多、葉緣呈鋸齒狀缺刻、葉脈和葉鞘常伴有不同長度的線狀脈腫。RGDV引起的水稻病害，主要影響了我國華南地區(qū)的水稻產(chǎn)量，電光葉蝶(Recilia dorsalis)和黑尾葉蝶(Nephotettixcinticeps)是其主要介體。病株的典型特征是葉背或葉鞘長有球狀的白色瘤狀突起，且植株矮縮明顯，嚴重影響水稻產(chǎn)量。
[0004]在田間，水稻不只感染單一的病毒，常以兩種或兩種以上病原混合侵染，無疑加重了水稻的發(fā)病情況，給糧食生產(chǎn)帶來了巨大威脅。因此，防止這些病害的發(fā)生和蔓延有利于水稻產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)步發(fā)展。
[0005]目前國內(nèi)有三重PCR檢測SRBSDV、RRSV和RGDV，但未發(fā)現(xiàn)同時檢測上述四種病毒的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種同時檢測水稻四種病毒的一步法多重PCR檢測方法，利用本發(fā)明的方法可以大量檢測水稻樣品，建立了能夠從水稻樣品中同時檢測RGDV、RRSV, SRBSDV和RBSDV四種病毒復(fù)合侵染的多重PCR檢測方法，成本低，特異性強，大大縮短了檢測時間，為制定科學的病蟲害防控體系提供了理論依據(jù)。
[0007]本發(fā)明的同時檢測水稻四種病毒的一步法多重PCR檢測方法，包括以下步驟: 步驟一，擴增引物的設(shè)計； 步驟二，樣品總RNA的提取；
步驟三，單重RT-PCR檢測；
步驟四，四重RT-PCR優(yōu)化；
步驟五，四重RT-PCR的靈敏度分析；
其中，步驟一中先下載病毒基因組序列，然后對下載的序列進行同源比對，以RGDV S8、RRSV S8、RBSDV S6和SRBSDV SlO為模板，設(shè)計特異引物，利用BLAST在線軟件檢測特異引物，四種病毒的引物具體如下:
水稻瘤矮病毒的引物為:
上游引物:5 ’ -GTACTCAGACCTGAACGTAGT-3，
下游引物:5’ -CTCAATAGCGATCGCATACC-3’
水稻齒葉矮縮病毒的引物為:
上游引物:5 ’ -CGCCGTATCTAACGTTCCAG-3’
下游引物:5’ -TGCCGCGACATAATCAAC-3’
南方水稻黑條矮縮病毒的引物為:
上游引物:5 ’ - CGCGTCATCTCAAACTACAG-3 ’
下游引物:5’ -TTTGTCAGCATCTAAAGCGC-3’
水稻黑條矮縮病毒的引物為:
上游引物:5 ’ -AATGCCACTTGCCAGTTACG-3，
下游引物:5’ -GCTACTTCGTCAGTTAGATC-3’。
[0008]優(yōu)選地，步驟二中的具體步驟如下:
(O分別剪取病害癥狀明顯的水稻葉片約0.2g，液氮研磨后加入800 μ I Trizol和400 μ I的氯仿:異戊醇后轉(zhuǎn)入2.0ml離心管渦旋混勻，其中，氯仿:異戊醇=24:1 ;
(2)4°C下12000rpm離心15min,取上清液于新的1.5ml離心管中加入等體積的預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻后置于_20°C下20min ；
(3)然后4°CT 12000rpm 離心 1min,棄上清；
(4)加入75%的預(yù)冷的乙醇，4°C下7500rpm離心5min,室溫晾干沉淀后加入10ul無RNase的水溶解，_20°C保存?zhèn)溆没蚶^續(xù)下游實驗。
[0009]優(yōu)選地，步驟三中的單重RT-PCR檢測包括以下步驟:
(1)一步法RT-PCR擴增:PCR反應(yīng)體系為:20ul反應(yīng)體系中，2X1 step buffer10.0ul，PrimeScript I step Enzyme Mix 0.5ul，RGDV、RRSV、SRBSDV 和 RBSDV 各 Iul 上下游引物混合物和1.0ul RNA模板，最后補水至20ul ；
PCR 反應(yīng)參數(shù)為:50°C反轉(zhuǎn)錄 30min，94°C預(yù)變性 2min;然后 94°C 30s, 55°C 30s, 72°Clmin，共35個循環(huán)；最后在72°C延伸lOmin，降溫至10°C結(jié)束反應(yīng)；
(2)PCR產(chǎn)物電泳檢測:取6ul PCR產(chǎn)物與Iul 6X loading buffer相混合，室溫下進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為電壓100V，時間40min，電泳結(jié)束后于凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果；
(3)電泳結(jié)果分析:分別得到RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV的擴增條帶，依次約為244bp、397bp、682bp和lOOObp，其大小與理論值相符。
[0010]其中，步驟四的四重RT-PCR優(yōu)化包括以下步驟: (O引物濃度比例的優(yōu)化:設(shè)置了 4個引物濃度組合:
第一組:RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV上下游引物混合物(各1umoI/L)均為0.125umol/L ；
第二組:RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV上下游引物混合物(各10umol/L)分別為0.2、0.125,0.125 和 0.25umol/L ；
第三組:RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV上下游引物混合物(各10umol/L)分別為0.2、0.125,0.125 和 0.3umol/L ；
第四組:RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV上下游引物混合物(各10umol/L)分別為0.25、0.25,0.25 和 0.3umol/L ；
按照單重RT-PCR檢測方法，進行多重RT-PCR反應(yīng)；
(2)DNA聚合酶用量的優(yōu)化JfTaqDNA聚合酶的用量設(shè)為四個梯度:2.5U、4U、5U和6U四個梯度，按照單重RT-PCR檢測方法，進行多重RT-PCR反應(yīng)；
(3)退火溫度的優(yōu)化:最后對退火溫度進行優(yōu)化，從52°C到62°C每1°C為一個梯度，按照單重RT-PCR檢測方法，進行多重RT-PCR反應(yīng)。
[0011]進一步的，在步驟四中，根據(jù)優(yōu)化的結(jié)果，多重PCR最佳反應(yīng)體系為:2X1 stepbuffer 10.0ul, RGDV、RRSV、SRBSDV 和 RBSDV 引物的終濃度依次為:0.2、0.125,0.125 和
0.25 umol/L, PrimeScript I step Enzyme Mix 2.5U,退火溫度為 58°C, RNA模板為 1.0ul,最后補水至20ul ;最后PCR反應(yīng)條件為:50°C反轉(zhuǎn)錄30min，94°C預(yù)變性2min ;然后94°C30s, 58°C 30s, 72°C lmin，共35個循環(huán)；最后在72°C延伸lOmin，降溫至10°C結(jié)束反應(yīng)。
[0012]優(yōu)選地，步驟五中，取濃度相當?shù)乃姆N病毒總RNA等體積混合在一起作為復(fù)合模板，測其含量后作5倍梯度稀釋，共7個濃度梯度，采用步驟四中優(yōu)化的方法，進行多重PCR擴增以檢測其敏感性。
[0013]相比于現(xiàn)有檢測方法，本發(fā)明同時檢測水稻四種病毒的一步法多重PCR檢測方法具有以下優(yōu)勢:本發(fā)明能有效的檢測水稻4種病毒，快速準確，穩(wěn)定性好，特異性強，避免了PCR的重復(fù)檢測，減少了工作量，實現(xiàn)了水稻多種病毒的高效快速檢測，有利于研究田間4種病害的發(fā)生程度，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重要的指導(dǎo)意義。
【附圖說明】
[0014]圖1為四種病毒引物PCR檢測特異性電泳圖譜，M:DL2000 DNA分子量標準；1、3、5、7依次為:RGDV、RRSV、SRBSDV、RBSDV ;2、4、6、8分別為相對應(yīng)的陰性對照。
[0015]圖2為四種病毒引物濃度優(yōu)化圖譜，M:DL2000 DNA分子量標準；1_4依次為:第一組、第二組、第三組、第四