包含兩種工程化改造成具有降低的和升高的效應(yīng)器功能的抗體的組合物改進(jìn)的免疫療法
【專利說(shuō)明】包含兩種工程化改造成具有降低的和升高的效應(yīng)器功能的 抗體的組合物改進(jìn)的免疫療法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 一般而言，本發(fā)明涉及免疫療法。更特別地，本發(fā)明關(guān)注靶向抗原的免疫綴合物和 Fc工程化抗體，其作為免疫治療劑組合使用。另外，本發(fā)明涉及包含所述免疫綴合物和抗體 組合的藥物組合物及在疾病的治療中使用該組合的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 在多種臨床背景中，經(jīng)常期望選擇性破壞個(gè)別細(xì)胞或特定細(xì)胞類型。例如，癌癥治 療的一個(gè)主要目的是特異性破壞腫瘤細(xì)胞，而使健康細(xì)胞和組織保持完整且未受損。
[0004] 實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)的一種誘人方式誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答使得免疫效應(yīng)細(xì)胞諸如天 然殺傷（NK)細(xì)胞或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL)攻擊和破壞腫瘤細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可通過(guò)多 種刺激來(lái)激活，包括多種細(xì)胞因子，它們經(jīng)由結(jié)合免疫細(xì)胞表面上它們的受體來(lái)誘導(dǎo)信號(hào) 傳導(dǎo)事件。例如，刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖和激活等等的白介素-2 (IL-2)已經(jīng)批 準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌和惡性黑素瘤。然而，血液清除迅速和缺乏腫瘤特異性要求系 統(tǒng)性施用高劑量的細(xì)胞因子以在腫瘤部位實(shí)現(xiàn)足夠高濃度的細(xì)胞因子以激活免疫應(yīng)答或 具有抗腫瘤效果。這些高系統(tǒng)水平的細(xì)胞因子可導(dǎo)致嚴(yán)重的毒性和不良反應(yīng)，正如IL-2的 情況。為了在癌癥治療中使用，因此想要將細(xì)胞因子特異性投遞至腫瘤或腫瘤微環(huán)境。這可 以通過(guò)將細(xì)胞因子綴合至靶向模塊，例如對(duì)腫瘤抗原特異性的抗體或抗體片段來(lái)實(shí)現(xiàn)。此 類免疫綴合物的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們與未綴合細(xì)胞因子相比延長(zhǎng)的血清半衰期。它們?cè)诟?的劑量將腫瘤部位的免疫刺激活性最大化同時(shí)保持系統(tǒng)副作用最小的能力使得細(xì)胞因子 免疫綴合物成為最佳的免疫治療劑。
[0005] 激活效應(yīng)細(xì)胞的另一種方式是經(jīng)由通過(guò)免疫球蛋白的Fc部分或包含F(xiàn)c區(qū)的重 組融合蛋白銜接它們表面上的活化性Fc受體?？贵w由其Fc區(qū)介導(dǎo)的所謂效應(yīng)器功能是 基于抗體的癌癥免疫療法中的一種重要作用機(jī)制。當(dāng)結(jié)合至細(xì)胞表面的抗體與NK細(xì)胞上 的Fc受體相互作用時(shí)，觸發(fā)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，由NK細(xì)胞破壞抗體包被的 靶細(xì)胞（例如腫瘤細(xì)胞）。NK細(xì)胞表達(dá)FcyRllla(⑶16a)，其識(shí)別IgGl或IgG3亞類的免 疫球蛋白。別的效應(yīng)器功能包括抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬（ADCP)和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒 性（CDC)，而且隨抗體的類和亞類而變化，因?yàn)椴煌愋偷拿庖呒?xì)胞攜帶不同套的Fc受體， 它們識(shí)別不同型和亞型的免疫球蛋白重鏈恒定域（例如a、S、 Y、e、或y重鏈恒定域， 分別與IgA、IgD、IgE、IgG、或IgM類抗體對(duì)應(yīng)）。已經(jīng)采用多種策略來(lái)提高抗體的效應(yīng)器 功能。例如，Shields et al.，J Biol Chem 9 (2) ,6591-6604 (2001)顯示 Fc 區(qū)位置 298、 333、和/或334 (EU殘基編號(hào)方式）處的氨基酸替代改進(jìn)抗體對(duì)FcyIlia受體的結(jié)合和 ADCC。例如，美國(guó)專利 No. 6, 737, 056 ;W0 2004/063351;及 W0 2004/099249 中記載了別的 具有Fc區(qū)中的氨基酸修飾且展現(xiàn)改進(jìn)的Fc受體結(jié)合和效應(yīng)器功能的抗體變體。或者，可 通過(guò)改變抗體的糖基化來(lái)獲得升高的Fc受體結(jié)合和效應(yīng)器功能。癌癥免疫療法中最常用 的抗體，IgGl型抗體具有Fc區(qū)每個(gè)CH2域中Asn 297處保守的N-連接糖基化位點(diǎn)。兩個(gè) 附著至Asn 297的復(fù)合雙觸角寡糖埋藏在CH2域之間，形成與多肽骨架的廣泛接觸，而且 它們的存在對(duì)于抗體介導(dǎo)效應(yīng)器功能（包括抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC))是 必須的（Lifely et al.，Glycobiology 5,813-822(1995) ;JefTeris et al.，Immunol Rev 163,59-76(1998) ;Wright and Morrison, Trends Biotechnol 15,26-32(1997))。蛋白 質(zhì)工程研究顯示了 FcyR與IgG CH2域的更低鉸鏈區(qū)相互作用（Lund et al.，J Immunol 157,4963-69(1996))。然而，F(xiàn)cyR結(jié)合也要求存在CH2區(qū)中的寡糖（Lund et al.，J Immunol 157,4963-69(1996) ；ffright and Morrison, Trends Biotech 15,26-31 (1997)), 提示寡糖和多肽二者任一直接促成相互作用位點(diǎn)，或者維持活性CH2多肽構(gòu)象需要寡糖。 因此可以作為提高IgGl和FcyR之間相互作用的親和力，和提高IgGl抗體的ADCC活性 的手段來(lái)探索對(duì)寡糖結(jié)構(gòu)的修飾。Umafia et al.，Nat Biotechnol 17,176-180(1999) 及美國(guó)專利No. 6, 602, 684(WO 99/54342)(據(jù)此通過(guò)提述完整收錄其內(nèi)容）顯示催化兩分 型寡糖形成的糖基轉(zhuǎn)移酶，0 (1，4)-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶III(GnTIII)在中國(guó)倉(cāng)鼠卵 巢（CH0)細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)顯著提高那些細(xì)胞中生成的抗體的體外ADCC活性。生產(chǎn)細(xì)胞 系中GnTIII的過(guò)表達(dá)產(chǎn)生兩分型寡糖（它們一般也是非巖藻糖基化且屬于雜合型）富 集的抗體。如果在GnTIII以外，還在生產(chǎn)細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)甘露糖苷酶II(Manll)，那么獲 得復(fù)合型的兩分型、非巖藻糖基化寡糖富集的抗體（Ferrara et al.，Biotechn Bioeng 93,851-861(2006))。兩種類型的抗體均顯示與具有未修飾聚糖的抗體相比強(qiáng)烈升高 的ADCC，但是只有大多數(shù)N-聚糖為復(fù)合型的抗體能夠誘導(dǎo)顯著的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性 (Ferrara et al.，Biotechn Bioeng 93,851-861(2006))。ADCC 活性升高的關(guān)鍵因素看 來(lái)是自寡糖核心最里面的N-乙酰葡糖胺殘基消除巖藻糖，這改進(jìn)IgG Fc域?qū)cyRIIIa 的結(jié)合（Shinkawa et al.，J Biol Chem 278,3466-3473(2003))。別的用于生成具有巖 藻糖基化降低的抗體的方法包括例如在a (1，6)_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶缺陷宿主細(xì)胞中表達(dá) (Yamane-Ohnuki et al. , Biotech Bioeng 87,614-622(2004) ；Niwa et al. , J Immunol Methods 306,151-160(2006))。
[0006] 盡管通過(guò)使用游離細(xì)胞因子、免疫綴合物或工程化抗體在抗癌免疫療法中實(shí)現(xiàn)了 成功，然而癌癥療法持續(xù)需要新的有效且安全的治療選項(xiàng)。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這兩種用于局部免疫細(xì)胞激活的策略的組合，即細(xì)胞因子免疫綴 合物和工程化改造成具有升高的效應(yīng)器功能的抗體對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的同時(shí)刺激，大大提高抗癌 免疫療法的功效。
[0009] 因而，本發(fā)明提供（a)包含工程化改造成具有降低的效應(yīng)器功能的第一抗體和效 應(yīng)器模塊的免疫綴合物，和（b)工程化改造成具有升高的效應(yīng)器功能的第二抗體的組合， 其用于在有所需要的個(gè)體中治療疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述效應(yīng)器模塊為細(xì)胞因子。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞因子選自下組：IL_2, GM-CSF，IFN-a，和IL-12。在一個(gè)特定 實(shí)施方案中，所述效應(yīng)器模塊為IL-2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述效應(yīng)器模塊為IL-12。在 另一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述IL-2效應(yīng)器模塊為突變型IL-2效應(yīng)器模塊，其包含至少一處 與非突變型IL-2效應(yīng)器模塊相比降低或消除突變型IL-2效應(yīng)器模塊對(duì)IL-2受體a亞 基的親和力但保留突變型IL-2效應(yīng)器模塊對(duì)中間親和力IL-2受體的親和力的氨基酸突 變，特別是氨基酸替代。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述突變型IL-2效應(yīng)器模塊在選自與人 IL-2(SEQ ID N0:1)殘基42、45、和72對(duì)應(yīng)的位置的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)位置處包含一處、兩 處或三處氨基酸替代。在一個(gè)更加具體實(shí)施方案中，所述突變型IL-2效應(yīng)器模塊在與人 IL-2殘基42、45和72對(duì)應(yīng)的位置處包含三處氨基酸替代。在一個(gè)甚至更加具體實(shí)施方案 中，所述突變型IL-2效應(yīng)器模塊為包含氨基酸替代F42A、Y45A和L72G的人IL-2。在某些 實(shí)施方案中，所述突變型IL-2效應(yīng)器模塊在與人IL-2位置3對(duì)應(yīng)的位置處另外包含氨基 酸突變，其消除IL-2的0-糖基化位點(diǎn)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述突變型IL-2效應(yīng)器 模塊包含氨基酸序列SEQ ID N0 :2。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述效應(yīng)器模塊為單鏈效應(yīng)器模 塊。
[0010] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一抗體是全長(zhǎng)IgG類抗體，特別是全長(zhǎng)IgGl亞類抗 體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述效應(yīng)器模塊與所述第一抗體共享氨基或羧基末端肽鍵。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述效應(yīng)器模塊與所述第一抗體分享氨基末端肽鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述效應(yīng)器模塊在其N末端處融合至所述第一抗體的重鏈之一的C末端。在一個(gè)特定實(shí) 施方案中，所述免疫綴合物包含不多于一個(gè)效應(yīng)器模塊。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫綴 合物基本上由通過(guò)一個(gè)或多個(gè)肽接頭連接的效應(yīng)器模塊和第一抗體組成。在一個(gè)具體實(shí) 施方案中，所述免疫綴合物包含效應(yīng)器模塊，特別是單