一種苯酚人工抗原合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種人工抗原合成方法，具體為高免疫活性的苯酪人工抗原合成方 法。
【背景技術(shù)】
[000引苯酪（化學(xué)式；C品OH，化地)，又名石炭酸、哲基苯，是一種重要的有機(jī)化工原料， 環(huán)境中的苯酪主要來(lái)源于煉焦，煉油，石油化工，化肥，農(nóng)藥，塑料制造，燃燒等過(guò)程，卷煙燃 燒過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生該化合物，屬于卷煙煙氣走種有害成份之一。苯酪主要由呼吸道和皮膚 進(jìn)入人體而引起中毒，屬高毒類物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞有直接損害，能使粘膜，屯、血管和中樞神經(jīng)系 統(tǒng)受到腐蝕，損害和抑制，對(duì)生物體的危害很大，給環(huán)境會(huì)造成嚴(yán)重的污染。因此亟需建立 一種簡(jiǎn)單，快速，特異性強(qiáng)的苯酪測(cè)定及降害方法。
[0003] 目前苯酪的分析方法包括光度法，色譜法和電化學(xué)法等，該些方法分析測(cè)定苯酪 時(shí)需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，耗時(shí)較長(zhǎng)，且儀器昂貴，操作復(fù)雜，無(wú)法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)分析；同 時(shí)，煙草行業(yè)一直在積極探索各類方法降低卷煙煙氣中苯酪的含量，現(xiàn)有的方法主要包括 在濾嘴中添加活性炭或其它介孔材料吸附去除有害物質(zhì)，然而該些材料很難特異性吸附有 害物質(zhì)，往往也將煙氣中的香味成分一同吸附，造成卷煙香味損失。為了能及時(shí)、快速、簡(jiǎn)便 的分析并降低環(huán)境、卷煙產(chǎn)品中苯酪的含量，需要發(fā)展一種苯酪的專一性檢測(cè)及降害技術(shù)。 因此建立成本低、快速、結(jié)果準(zhǔn)確、方法通用性強(qiáng)的酶聯(lián)免疫技術(shù)方法非常必要。為了得到 特異性強(qiáng)，靈敏度高、價(jià)格低廉的高效抗體，該就需要合成能產(chǎn)生特異性抗體的免疫抗原。 但由于苯酪分子量較小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，與載體蛋白直接相連不易誘導(dǎo)產(chǎn)生效價(jià)高、特異性好的 抗體，且苯酪分子不含有直接能與蛋白偶聯(lián)的活性基團(tuán)，因此選擇結(jié)構(gòu)類似的替代物阿魏 酸原料作為苯酪結(jié)構(gòu)相似物，W =正了胺為催化劑，與氯甲酸異了醋反應(yīng)生成混合酸酢，然 后與生物高分子載體蛋白BSA等進(jìn)行的偶聯(lián)，經(jīng)透析純化，冷凍干燥。通過(guò)高分辨率質(zhì)譜技 術(shù)計(jì)算出半抗原小分子在載體蛋白上的偶聯(lián)數(shù)，獲得具有較高免疫原性的苯酪人工抗原。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種苯酪人工抗原的制備方法，所制備的高活性抗原可用 于免疫產(chǎn)生針對(duì)苯酪的抗體，為建立酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法檢測(cè)苯酪奠定基礎(chǔ)。
[0005] 本發(fā)明是通過(guò)W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 本發(fā)明第一方面公開(kāi)了一種苯酪人工抗原的制備方法，W阿魏酸為苯酪結(jié)構(gòu)相似 物，在叔胺催化下，阿魏酸和氯甲酸異了醋反應(yīng)，生成阿魏酸甲酸異了醋混合酸酢作為半抗 原，然后采將生成的阿魏酸甲酸異了醋混合酸酢與載體蛋白偶聯(lián)，制備苯酪人工抗原。
[0007] 制得的苯酪人工抗原利用基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀測(cè)定其分子量，將人 工抗原與載體蛋白分子質(zhì)量進(jìn)行比較，根據(jù)所得差值和半抗原分子量計(jì)算偶聯(lián)比，從而為 免疫產(chǎn)生針對(duì)苯酪的特異性抗體、建立酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。
[000引一種苯酪人工抗原的制備方法，具體包括W下步驟：
[0009] (1)將阿魏酸溶解于溶劑中，加入催化劑，W及反應(yīng)試劑氯甲酸異了醋，反應(yīng)；
[0010] (2)反應(yīng)完全后靜置，然后離屯、分離，獲得阿魏酸甲酸異了醋混合酸酢上清液；
[0011] (3)取載體蛋白溶解于緩沖溶液中，然后緩慢滴加步驟（2)分離得到的醋混合酸 酢上清液，進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，制得苯酪人工抗原。
[001引其中，
[0013] 優(yōu)選的，步驟（1)中，所述溶解采用的方式為超聲溶解，超聲頻率30~45曲Z，功率 200~300W，更優(yōu)選為超聲頻率40曲Z，功率200W。
[0014] 優(yōu)選的，步驟（1)中，所述溶劑選自二氧六環(huán)和N，N-二甲基甲酯胺。
[0015] 優(yōu)選的，步驟（1)中，所述催化劑選自=正了胺和=己胺，更優(yōu)選=正了胺。
[0016] 優(yōu)選的，步驟（1)中，所述阿魏酸、溶劑、催化劑和反應(yīng)試劑的質(zhì)量比例為0.5~1 ; 20 ~40 ;0. 5 ~1 ;0. 5 ~2。
[0017] 優(yōu)選的，步驟（1)中，所述反應(yīng)的方式為室溫?cái)埌璺磻?yīng)，反應(yīng)的時(shí)間為1-3小時(shí)。
[0018] 優(yōu)選的，步驟（2)中，所述靜置的溫度為4~25°C，更優(yōu)選為20°C ;靜置的時(shí)間為 1~3小時(shí)，更優(yōu)選為1小時(shí)。
[0019] 優(yōu)選的，步驟（2)中，所述離屯、分離的轉(zhuǎn)速為4000~1000化pm，更優(yōu)選為 8000;rpm ;離屯、的時(shí)間為10~20min，更優(yōu)選為lOmin。
[0020] 優(yōu)選的，步驟（3)中，所述載體蛋白選自牛血清白蛋白炬SA)、人血清白蛋白 化SA)、卵清白蛋白（OVA)和鑰孔血藍(lán)蛋白化L田，更優(yōu)選用容易產(chǎn)生抗原效應(yīng)的牛血清白 蛋白炬SA)。
[0021] 優(yōu)選的，步驟（3)中，采用超聲溶解的方式將載體蛋白溶解于緩沖液中。
[0022] 優(yōu)選的，步驟（3)中，載體蛋白、緩沖溶液與混合酸酢上清液的質(zhì)量之比為0. 1~ 0. 2 ;10 ~15 ;2 ~4。
[002引優(yōu)選的，步驟做中，所述緩沖溶液為PBS緩沖液，所述PBS緩沖液的抑= 7. 2-7. 4,包括 W下濃度的組分；NaCl 為 137mmol/L，KC1 為 2. 7mmol/L，化2冊(cè)04為 lOmmol/ L KH2PO4為 2mmol/l，其余為水。
[0024] 優(yōu)選的，步驟（3)中，所述滴加的速度為2~4滴/s。
[0025] 優(yōu)選的，步驟（3)中，所述偶聯(lián)反應(yīng)的條件為冰水浴條件；所述偶聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間為 6~10小時(shí)，更優(yōu)選為8小時(shí)。
[0026] 進(jìn)一步的，步驟（3)反應(yīng)結(jié)束后，還包括苯酪人工抗原的分離過(guò)程；(a)取透析袋 并進(jìn)行前處理，去除二氧六環(huán)W及其他雜質(zhì)；化）將步驟（3)偶聯(lián)反應(yīng)制得的苯酪人工抗 原混合液移入處理后的透析袋中，然后將透析袋置于PBS緩沖液中進(jìn)行第一次攬拌透析處 理，之后再置于去離子水中進(jìn)行第二次攬拌透析處理；（C)透析結(jié)束后，將透析袋中的人工 抗原溶液冷凍處理，然后冷凍干燥，制得苯酪人工抗原白色粉末。
[0027] 優(yōu)選的，步驟（a)中，所述透析袋的前處理過(guò)程為：取寬度為10~15cm規(guī)格的透 析袋，置于含2wt%的碳酸氨鋼和Immol/L的邸TA混合水溶液中煮沸l(wèi)Omin，取出透析袋用 蒸饋水沖洗干凈；取Immol/L邸TA水溶液并用稀化0H溶液調(diào)抑為8左右，然后將透析袋 置于其中再次煮沸l(wèi)Omin，最后用去離子水浸泡洗凈后放在4°C冰