一種兩面針內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種兩面針內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物內(nèi)生真菌是指部分或全部生活史存在于植物的組織和器官內(nèi)部的真菌，其可 通過(guò)從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內(nèi)擴(kuò)增出DNA的方法來(lái)證明其內(nèi)生 性，而且被感染的宿主植物卻不表現(xiàn)出外在病癥。1993年，美國(guó)科學(xué)家從藥用紅豆杉組織中 分離到一株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌后，引起了人們對(duì)植物內(nèi)生真菌及其活性物質(zhì)開發(fā)的研究 熱潮，隨著研究的深入，人們還發(fā)現(xiàn)，某些植物的內(nèi)生真菌除了能產(chǎn)生與寄主植物相同的活 性成分外，還能產(chǎn)生與寄主植物不同的活性成分，再加上植物內(nèi)生菌作為微生物，具有生長(zhǎng) 速度快、易于工業(yè)化發(fā)酵等特點(diǎn)，因此從植物內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)有醫(yī)用價(jià)值的內(nèi)生菌株及化 合物已成為醫(yī)藥工作者研究的新熱點(diǎn)。
[0003] 我國(guó)植物種類繁多，不同的寄主植物，其內(nèi)生真菌的種類和數(shù)量的差別相當(dāng)大。因 此，對(duì)具醫(yī)用價(jià)值的內(nèi)生菌株的篩選中應(yīng)采取一定的策略，一般來(lái)講，從具藥用的植物中分 離篩選到醫(yī)用價(jià)值內(nèi)生菌株的機(jī)率較大，而某些作為民族藥、特色藥的藥用植物，如兩面針 等藥用植物，其所含的內(nèi)生真菌很可能具有產(chǎn)生新穎藥用物質(zhì)的潛力。此外，在藥用植物資 源日漸枯竭、生態(tài)環(huán)境及生物多樣性受到嚴(yán)重威脅的今天，加強(qiáng)對(duì)兩面針等藥用植物內(nèi)生 真菌的研究并對(duì)其加W開發(fā)利用具有良好的應(yīng)用潛力。但人們?cè)趯?duì)兩面針等藥用植物內(nèi)生 真菌的研究中還有W下不少問(wèn)題有待完善，例如；（1)某些植物內(nèi)生真菌種類在人工培養(yǎng) 基中生長(zhǎng)不好，因此不能保證所有的內(nèi)生真菌菌株被全部被分離出來(lái)，因而部分活性菌株 會(huì)漏篩，也無(wú)法做進(jìn)一步的后繼研究；(2)部分獲得的植物內(nèi)生真菌菌種在保存的過(guò)程中 會(huì)自然消亡或失活。
[0004] 因此本領(lǐng)域是通過(guò)皿內(nèi)培養(yǎng)的方式，獲得足夠的兩面針內(nèi)生真菌的種類，為進(jìn)一 步提取、純化、鑒定兩面針內(nèi)生真菌胞內(nèi)及胞外的藥用活性物質(zhì)提供基礎(chǔ)。中國(guó)專利公開了 一些細(xì)菌、真菌和植物的培養(yǎng)基或分離培養(yǎng)基，例如；CN 102719386 A，一種細(xì)菌、真菌菌種 保存培養(yǎng)基；CN 103396968 A，一種細(xì)菌培養(yǎng)基及其應(yīng)用；CN 1488751 A，一種真菌細(xì)菌培 養(yǎng)基；CN 104277987 A，牛憧菌培養(yǎng)基；CN 103952319 A，一種食線蟲真菌分離、純化和保存 培養(yǎng)基；CN 102965308 A，一種分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基及其應(yīng)用；CN 103396970 A， 一種分離鋪氧化菌的培養(yǎng)基；CN 102754655 A，一種簡(jiǎn)便的腐霉菌快速分離培養(yǎng)基等。目前 關(guān)于兩面針內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)基的研究和應(yīng)用未見公開文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明的培養(yǎng)基顯著 提高了所分離得到的兩面針內(nèi)生真菌的數(shù)量，避免了在內(nèi)生真菌分離過(guò)程中的漏篩，而且 具有保存菌種時(shí)間長(zhǎng)，菌株繼代培養(yǎng)穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種適合兩面針內(nèi)生真菌分離和保存的培養(yǎng)基。
[0006] 本發(fā)明所述的兩面針內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)基，其特征在于兩面針枝葉粉、玉米粉、 葡萄糖、酵母膏、無(wú)機(jī)鹽、瓊脂粉和水組成。
[0007] 所述的兩面針內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)基，其特征在于，兩面針枝葉粉15-60g、玉米粉 15-60g、葡萄糖10-20g、酵母膏l(xiāng)-2g、無(wú)機(jī)鹽0. 7-2. Ig、瓊脂粉20g，蒸饋水補(bǔ)足1L。
[000引所述的兩面針內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)基，其特征在于，優(yōu)選的兩面針枝葉粉36g、玉 米粉36g、葡萄糖17g、酵母膏1. 6g、無(wú)機(jī)鹽1. 6g、瓊脂粉20g，蒸饋水補(bǔ)足1L。
[0009] 所述的兩面針內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)基，其特征在于所述的無(wú)機(jī)鹽為其特征在于所 述的無(wú)機(jī)鹽為K2HP〇4、kh2P〇4、m拆〇4.%〇、化化按重量份1 : 1 : 1 : 1的比例混合而成。
[0010] 所述的兩面針內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)基在兩面針內(nèi)生真菌的培養(yǎng)、保存中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明有W下顯著效果：
[0012] (1)顯著提高了從兩面針各部位所分離得到的兩面針內(nèi)生真菌的數(shù)量。
[0013] (2)對(duì)已經(jīng)獲得的兩面針內(nèi)生真菌菌株具有保存菌種時(shí)間長(zhǎng)，菌株繼代培養(yǎng)穩(wěn)定 性好的優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。應(yīng)該指出的是，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說(shuō)明 本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明 要求保護(hù)的范圍。
[00巧]實(shí)施例1
[0016] 兩面針枝葉粉16g、玉米粉60g、葡萄糖llg、酵母膏Ig、無(wú)機(jī)鹽0. 8g、瓊脂粉20g， 蒸饋水補(bǔ)足1L。
[0017] 將兩面針枝葉粉和玉米粉加蒸饋水比，沸煮0. 5h，過(guò)濾后的濾液依次加入規(guī)定量 的葡萄糖、酵母膏、無(wú)機(jī)鹽、瓊脂粉，最后W蒸饋水補(bǔ)足比，在高壓蒸汽滅菌器內(nèi)121°C (壓 力0.1 MPa)條件下，滅菌30min后取出備用。
[001引 實(shí)施例2
[0019] 兩面針枝葉粉58g、玉米粉15g、葡萄糖19g、酵母膏2g、無(wú)機(jī)鹽2g、瓊脂粉20g，蒸 饋水補(bǔ)足1L。
[0020] 將兩面針枝葉粉和玉米粉加蒸饋水比，沸煮0. 5h，過(guò)濾后的濾液依次加入規(guī)定量 的葡萄糖、酵母膏、無(wú)機(jī)鹽、瓊脂粉，最后W蒸饋水補(bǔ)足比，在高壓蒸汽滅菌器內(nèi)121°C (壓 力0.1 MPa)條件下，滅菌30min后取出備用。
[0021] 實(shí)施例3
[0022] 兩面針枝葉粉30g、玉米粉30g、葡萄糖15g、酵母膏1. 2g、無(wú)機(jī)鹽1. 4g、瓊脂粉 20g，蒸饋水補(bǔ)足1L。
[0023] 將兩面針枝葉粉和玉米粉加蒸饋水比，沸煮0. 5h，過(guò)濾后的濾液依次加入規(guī)定量 的葡萄糖、酵母膏、無(wú)機(jī)鹽、瓊脂粉，最后W蒸饋水補(bǔ)足比，在高壓蒸汽滅菌器內(nèi)121°C (壓 力0.1 MPa)條件下，滅菌30min后取出備用。
[0024] 實(shí)施例4
[0025] 兩面針枝葉粉36g、玉米粉36g、葡萄糖18g、酵母膏1. 5g、無(wú)機(jī)鹽1. 6g、瓊脂粉 20g，蒸饋水補(bǔ)足1L。
[0026] 將兩面針枝葉粉和玉米粉加蒸饋水比，沸煮0. 5h，過(guò)濾后的濾液依次加入規(guī)定量 的葡萄糖、酵母膏、無(wú)機(jī)鹽、瓊脂粉，最后W蒸饋水補(bǔ)足比，在高壓蒸汽滅菌器內(nèi)i2rc (壓 力0.1 MPa)條件下，滅菌30min后取出備用。
[0027] 實(shí)施例5
[002引兩面針枝葉粉26g、玉米粉25g、葡萄糖17g、酵母膏1. 6g、無(wú)機(jī)鹽1. 2g、瓊脂粉 20g，蒸饋水補(bǔ)足1L。
[0029] 將兩面針枝葉粉和玉米粉加蒸饋水比，沸煮0. 5h，過(guò)濾后的濾液依次加入規(guī)定量 的葡萄糖、酵母膏、無(wú)機(jī)鹽、瓊脂粉，最后W蒸饋水補(bǔ)足比，在高壓蒸汽滅菌器內(nèi)121°C (壓 力0.1 MPa)條件下，滅菌30min后取出備用。
[0030] 實(shí)施例6
[0031] 兩面針枝葉粉45g、玉米粉48g、葡萄糖13g、酵母膏1. 4g、無(wú)機(jī)鹽1. 2g、瓊脂粉 20g，蒸饋水補(bǔ)足1L。
[0032] 將兩面針枝葉粉和玉米粉加蒸饋水比，沸煮0. 5h，過(guò)濾后的濾液依次加入規(guī)定量 的葡萄糖、酵母膏、無(wú)機(jī)鹽、瓊脂粉，最后W蒸饋水補(bǔ)足比，在高壓蒸汽滅菌器內(nèi)121°C (壓 力0.1 MPa)條件下，滅菌30min后取出備用。
[0033] 實(shí)施例7
[0034] 兩面針枝葉粉54g、玉米粉55g、葡萄糖19g、酵母膏1. Ig、無(wú)機(jī)鹽2. Ig、瓊脂粉 20g，蒸饋水補(bǔ)足1L。
[0035] 將兩面針枝葉粉和玉米粉加蒸饋水比，沸煮0. 5h，過(guò)濾后的濾液依次加入規(guī)定量 的葡萄糖、酵母膏、無(wú)機(jī)鹽、瓊脂粉，最后W蒸饋水補(bǔ)足比，在高壓蒸汽滅菌器內(nèi)121°C (壓 力0.1 MPa)條件下，滅菌30min后取出備用。
[0036] 實(shí)施例8
[0037] 兩面針枝葉粉36g、玉米粉36g、葡萄糖18g、酵母膏1. 5g、無(wú)機(jī)鹽1. 6g、瓊脂粉 20g，蒸饋水補(bǔ)足1L。
[003引將兩面針枝葉粉和玉米粉加蒸饋水比，沸煮0. 5h，過(guò)濾后的濾液依次加入規(guī)定量 的葡萄糖、酵母膏、無(wú)機(jī)鹽、瓊脂粉，最后W蒸饋水補(bǔ)足比，在高壓蒸汽滅菌器內(nèi)121°C (壓 力0.1 MPa)條件下，滅菌30min后取出備用。
[0039] 實(shí)施例9
[0040] 兩面針枝葉粉26g、玉米粉24g、葡萄糖15g、酵母膏1. 7g、無(wú)機(jī)鹽1. 7g、瓊脂粉 20g，蒸饋水補(bǔ)足1L。
[0041] 將兩面針枝葉粉和玉米粉加蒸饋水比，沸煮0. 5h，過(guò)濾后的濾液依次加入規(guī)定量 的葡萄糖、酵母膏、無(wú)機(jī)鹽、瓊脂粉，最后W蒸饋水補(bǔ)足比，在高壓蒸汽滅菌器內(nèi)121°C (壓 力0.1 MPa)條件下，滅菌30min后取出備用。
[0042] 實(shí)施例10
[00創(chuàng)實(shí)施例1~9所制得的培養(yǎng)基作為分離培養(yǎng)基，W馬鈴馨瓊脂培養(yǎng)基（PDA)和玉 米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA)作為對(duì)照培養(yǎng)基，采用組織分離法對(duì)兩面針根、莖、葉和果實(shí)部分的 內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，將表面消毒過(guò)的根、莖和果實(shí)部分在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌刀片去除表 皮組織，并切割成長(zhǎng)、寬、高約5mm的小塊，葉片則直接切割成長(zhǎng)寬約5mm的小塊，每3個(gè)組 織塊放在PDA平板上，在25°C下避光培養(yǎng)，設(shè)3個(gè)重復(fù)。對(duì)所分離的內(nèi)生真菌進(jìn)行反復(fù)純 化，得到單一菌落后保存于4°C統(tǒng)計(jì)所分離得到的內(nèi)生真菌數(shù)量，結(jié)果見表1。
[0044] 表1發(fā)明實(shí)例培養(yǎng)基對(duì)兩面針內(nèi)生真菌的分離效果
[0045]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種兩面針內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)基，其特征在于由兩面針枝葉粉、玉米粉、葡萄糖、 酵母膏、無(wú)機(jī)鹽、瓊脂粉和水組成。
2. 如權(quán)利要求1所述兩面針內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)基，其特征在于，兩面針枝葉粉 15-60g、玉米粉15-60g、葡萄糖10-20g、酵母膏l(xiāng)-2g、無(wú)機(jī)鹽0. 7-2. lg、瓊脂粉20g，蒸餾水 補(bǔ)足1L。
3. 如權(quán)利要求1所述兩面針內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)基，其特征在于，兩面針枝葉粉36g、 玉米粉36g、葡萄糖17g、酵母膏1. 6g、無(wú)機(jī)鹽1. 6g、瓊脂粉20g，蒸餾水補(bǔ)足1L。
4. 如權(quán)利要求3所述兩面針內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)基，其特征在于所述的無(wú)機(jī)鹽為 K2HP04、KH 2P04、MgS04.7H20、NaCL 按重量份1 : 1 : 1 : 1 的比例混合而成。
5. 如權(quán)利要求1所述的兩面針內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)基在兩面針內(nèi)生真菌的分離、保存 中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種兩面針內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)基，培養(yǎng)基由兩面針枝葉粉、玉米粉、葡萄糖、硝酸鉀、無(wú)機(jī)鹽、瓊脂粉和水組成，制備方法為：將兩面針枝葉粉、玉米粉加蒸餾水1L，沸煮0.5h，過(guò)濾后的濾液依次加入規(guī)定量的葡萄糖、酵母膏、無(wú)機(jī)鹽、瓊脂粉，最后以蒸餾水補(bǔ)足1L，然后滅菌備用。本發(fā)明的培養(yǎng)基顯著提高了所分離得到的兩面針內(nèi)生真菌的數(shù)量，而且具有保存菌種時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】C12N1-14
【公開號(hào)】CN104673685
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510113277
【發(fā)明人】朱華, 梁子寧, 陳龍, 梁丹, 黃小燕
【申請(qǐng)人】廣西中醫(yī)藥大學(xué)
【公開日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2015年3月16日