豆科植物豆莢相關(guān)組織特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種豆科植物組織中的特異性 啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豆科植物具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。其中，大豆是植物蛋白和食用油的主要來源，也是 世界上產(chǎn)量最多的油料作物。大豆是豆科植物中最富有營養(yǎng)而又易于消化的食物，是蛋白 質(zhì)最豐富最廉價(jià)的來源。在今天世界上許多地方是人和動(dòng)物的主要食物。對(duì)于我國而言， 豆科植物，尤其是大豆，更是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物。
[0003] 常規(guī)育種方法在品質(zhì)改良和新品種選育方面發(fā)揮著重要作用，但也存在育種年限 長、難以打破性狀連鎖、多基因重組幾率低、遠(yuǎn)緣雜交困難等種種弊端。植物基因工程技術(shù) 能定向改良植物的不良性狀，使植物獲得常規(guī)方法難以得到的特定性狀，并能大大縮短育 種年限，提高經(jīng)濟(jì)效益。此種技術(shù)在供體總DNA導(dǎo)入前不經(jīng)過任何修飾和構(gòu)建，從而避免基 因構(gòu)建元件可能對(duì)生態(tài)和環(huán)境造成的負(fù)面影響。轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)可按人們的預(yù)選設(shè)計(jì)改良 作物，創(chuàng)造新種質(zhì)，豐富種質(zhì)資源，提高作物的品質(zhì)、抗性、耐性、增加產(chǎn)量等，可極大的提高 育種效率，加快育種進(jìn)程，對(duì)解決糧食和蔬菜安全、生態(tài)惡化、資源匱乏及效益低下等問題 具有重大的社會(huì)、生態(tài)和經(jīng)濟(jì)意義。
[0004] 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在我國主要農(nóng)作物育種（水稻、小麥、玉米、大豆、高粱、向日葵、油菜） 的應(yīng)用已取得成果。特別是在大豆育種上，采用外源DNA導(dǎo)入技術(shù)將優(yōu)良性狀的目的基因 導(dǎo)入栽培大豆，獲得的后代既保持了原有受體的產(chǎn)量，又培育出集高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、優(yōu)良性狀于 一體的新品種和品系。例如，20世紀(jì)90年代，雷勃鈞等人利用花粉管通道法將外源DNA導(dǎo) 入大豆，創(chuàng)造了優(yōu)質(zhì)高蛋白品系D89-982 (蛋白質(zhì)占45. 32% )和雙高品系D90 -1217 (蛋 白質(zhì)+脂肪占66% )。黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院利用花粉管通道法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，即外源DNA 直接導(dǎo)入OIED)技術(shù)，將高蛋白野生大豆總DNA直接導(dǎo)入栽培大豆，育成了第一個(gè)大豆新 品種--黑生101。1996年，徐香玲、李興華等利用具有質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌（大豆花葉病毒 外殼蛋白基因）感染大豆品種，得到轉(zhuǎn)化植株，為大豆抗病育種提供了新的途徑。徐香玲等 (1997)將PKT54B7C5上的B，t，K-8內(nèi)毒蛋白基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入大豆黑農(nóng)37、黑農(nóng) 39等品種，獲得外源基因?qū)氩⒄系酱蠖够蚪M中的再生大豆植株。2001年，周思軍、李 希臣等采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)成功地將Bt基因（crylA)導(dǎo)入大豆。1999 年，徐香玲等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將抗真菌的幾丁酶基因?qū)氪蠖蛊贩N--東農(nóng)37號(hào)、吉林 28號(hào)等14個(gè)品種，得到轉(zhuǎn)化植株。
[0005] 基因通過表達(dá)來體現(xiàn)其功能，而啟動(dòng)子是精確啟動(dòng)基因表達(dá)的"開關(guān)"。借助基因 工程的方法，利用組織特異性的啟動(dòng)子能夠?qū)χ参镞M(jìn)行針對(duì)性的育種改造。因此，組織特異 性啟動(dòng)子對(duì)于基因的表達(dá)調(diào)控研究具有重要意義。但是，出于種種原因，目前找到的組織特 異性啟動(dòng)子并不多。例如，有些基因，如非結(jié)構(gòu)基因會(huì)發(fā)生基因移轉(zhuǎn)，從而很難找到在特定 組織中特異性表達(dá)的相應(yīng)啟動(dòng)子。對(duì)于啟動(dòng)子區(qū)域的普遍特征僅僅知曉啟動(dòng)子位于基因轉(zhuǎn) 錄起始位點(diǎn)的上游幾kb的區(qū)域內(nèi)，具有一定的保守序列特征，GC含量較高等等，技術(shù)人員 并不能僅僅根據(jù)這些普遍特征來精確定位啟動(dòng)子；事實(shí)上，即便設(shè)計(jì)多對(duì)PCR引物，也很有 可能無法精確定位啟動(dòng)子。此外，由于種種原因，許多基因確切的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并未確定， 到目前為止，已闡明啟動(dòng)子序列以及它們的調(diào)控機(jī)制的基因數(shù)量非常有限。標(biāo)準(zhǔn)的真核生 物有關(guān)的啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫Eukaryotic Promoter Database中登錄的基因啟動(dòng)子也并不多。
[0006] 我國在轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)作物育種方面雖然已取得可喜成績，但與國際水平相 比仍有較大的差距。尋找有效的組織特異性基因，并構(gòu)建高效可用的轉(zhuǎn)化載體是改良大豆 品質(zhì)性狀和研究大豆功能基因的先決條件。但是轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒的構(gòu)建是該技術(shù)的瓶頸之一， 其主要原因是缺乏有效的轉(zhuǎn)基因載體能定向在豆科植物中進(jìn)行組成型表達(dá)，或進(jìn)行組織特 異型表達(dá)；以及缺乏能高效轉(zhuǎn)化的載體。
[0007] 綜上所述，本領(lǐng)域急需找到豆科植物，特別是大豆中的組織特異性啟動(dòng)子，進(jìn)而準(zhǔn) 確有效地改變豆科植物的各種性狀，改良其品系，更好地調(diào)控其生長發(fā)育以及產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種豆科植物的組織特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
[0009] 在第一方面，本發(fā)明提供一種啟動(dòng)子元件，所述啟動(dòng)子元件選自下組：
[0010] (a)核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所不的多核苷酸；
[0011] (b)核苷酸序列與SEQ ID NO: 1所示序列的同源性彡95%(較佳地彡98%)，且具有 豆科植物豆莢相關(guān)組織中特異啟動(dòng)功能的啟動(dòng)子活性的多核苷酸；
[0012] (c)如SEQ ID NO: 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或增加1-60個(gè)（較佳 地1-30,更佳地1-6個(gè)）核苷酸，且具有豆科植物豆莢相關(guān)組織中特異啟動(dòng)功能的啟動(dòng)子活 性的多核苷酸。
[0013] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的豆科植物豆莢相關(guān)組織中特異啟動(dòng)功能表示，所述 啟動(dòng)子在豆科植物的豆莢相關(guān)組織以外的組織中不具有啟動(dòng)功能。
[0014]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的豆科植物包括百脈根（Lotus corniculatus)、豌豆 (Lathyrus odoratus)、大豆（Glycine max)或苜猜（Medicago sativa) 〇
[0015] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的豆科植物豆莢相關(guān)組織包括豆莢或子葉。
[0016] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子元件的序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0017] 在第二方面，本發(fā)明提供一種構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有外源基因以及與外源基因 可操作連接的本發(fā)明第一方面所述的啟動(dòng)子元件。
[0018] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的外源基因在天然狀態(tài)下并不存在。
[0019] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述外源基因包括：抗性基因、篩選標(biāo)記基因、抗原蛋 白基因、RNAi基因、microRNA基因、生物制劑基因、或植物品質(zhì)相關(guān)基因。
[0020] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的抗性基因選自下組：抗除草劑基因、抗病毒基 因、耐寒基因、耐高溫基因、抗旱基因、抗?jié)郴?、或抗蟲基因。
[0021] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的篩選標(biāo)記基因選自下組：gus(0-葡萄糖苷酸 酶）基因、hyg(潮霉素）基因、neo (新霉素）基因、或gfp (綠色熒光蛋白）基因。
[0022] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的抗原蛋白基因選自下組：細(xì)菌類抗原蛋白（如 霍亂毒素B，破傷風(fēng)毒素等）、病毒類抗原蛋白（如犬細(xì)小病毒）、原生動(dòng)物類抗原蛋白（如 阿米巴病原LecA)、或自身抗原蛋白（如I型糖尿病的CTB - pins抗原蛋白）。
[0023] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的生物制劑基因選自下組：a 2b干擾素基因、或 胰島素樣生長因子基因。
[0024] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的植物品質(zhì)相關(guān)基因選自下組：氣基酸改良相關(guān) 基因、脂肪改良相關(guān)基因、淀粉改良相關(guān)基因、或雄性不育相關(guān)基因。
[0025] 在第三方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒從5'至3'依次具有下述元件： 權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子元件、基因0RF序列和終止子。
[0026] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的表達(dá)盒還包括選自下組的一種或多種元件：poly (A) 元件、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)運(yùn)元件、或基因靶向元件。
[0027] 在第四方面，本發(fā)明提供一種載體，所述載體含有本發(fā)明第一方面所述的啟動(dòng)子 元件、或本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)盒。
[0028] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述載體選自：細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、或植物細(xì)胞病 毒載體、穿梭載體。
[0029] 在第五方面，本發(fā)明提供一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有本發(fā)明第四方面所述 的載體、或其染色體上整合有外源的本發(fā)明第一方面所述的啟動(dòng)子元件、或其染色體上整 合有本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)盒。
[0030] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞的染色體具有一個(gè)或多個(gè)（如1-50個(gè)，較佳 地2-6個(gè)）拷貝的本發(fā)明第一方面所述的啟動(dòng)子元件、或本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)盒。
[0031] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的宿主細(xì)胞選自下組：原核細(xì)胞（如大腸桿菌、鏈 霉菌屬、或農(nóng)桿菌）、低等真核細(xì)胞（如酵母細(xì)胞）、或高等真核細(xì)胞（如植物細(xì)胞）。
[0032] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞，更佳地為農(nóng)作物、蔬菜、 或花舟的植物細(xì)胞，更佳地為豆科植物細(xì)胞，最佳地為百脈根（Lotus corniculatus)、豌豆 (Lathyrus odoratus)、大豆（Glycine max)或苜猜（Medicago sativa)植物細(xì)胞。
[0033] 在第六方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一方面所述的啟動(dòng)子元件，本發(fā)明第二方面所 述的構(gòu)建物，本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)盒特異性調(diào)控外源基因在豆科植物豆莢相關(guān)組織 中的表達(dá)的用途。
[0034] 在第七方面，本發(fā)明提供一種在豆科植物豆莢相關(guān)組織