壞死梭桿菌重組血凝素相關(guān)外膜蛋白及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種壞死梭桿菌重組血凝素相關(guān)外膜蛋 白及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 壞死梭桿菌是一種嚴格厭氧的革蘭氏陰性多形態(tài)桿菌，主要分布于人和動物的 口腔、胃腸道和泌尿生殖道，是一種條件致病菌，常引起人的急慢性咽喉炎（Lemierre' S syndrome)和牛、羊、鹿等反芻動物的腐蹄病和肝膿腫，多呈慢性經(jīng)過，如果治療不及時，會 引起動物蹄部以及肝、腎等內(nèi)臟器官出現(xiàn)膿腫、壞死等癥狀，進而影響動物的生產(chǎn)性能，給 養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。
[0003] 獲得某個特定蛋白質(zhì)的方法主要有兩種，第一種是通過分離純化的方法獲得天然 的蛋白質(zhì)，該方法適用于已知各種理化性質(zhì)（如：分子量、等電點、疏水性、配體特異性等） 的蛋白質(zhì)，這樣可以充分利用該蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，從天然材料中分離純化出特定的蛋白 質(zhì)，但是對于一些未知蛋白或者理化性質(zhì)未知的蛋白質(zhì)來說，該方法顯然不是經(jīng)濟有效的。 第二種是通過體外重組的方法，借助于表達載體和表達宿主，獲得重組的蛋白質(zhì)，該方法是 根據(jù)編碼特定蛋白質(zhì)的核苷酸序列，設(shè)計特異性引物，通過PCR擴增的方法，得到特定蛋白 質(zhì)的核苷酸序列，將該基因片段連接在表達載體上，轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染表達宿主，在適宜的條件 下進行表達，從而獲得重組的特異性蛋白質(zhì)。
[0004]目前已知細菌粘附宿主細胞是引起發(fā)病的首要步驟，而壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外 膜蛋白具有粘附作用，因此初步推測血凝素相關(guān)外膜蛋白在壞死梭桿菌致病過程中起著重 要的作用。目前，在GenBank中公布有壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基因的部分核苷酸 序列，但是對壞死梭桿菌全基因組及梭菌屬的其他細菌的研究較少，仍有許多基因包括血 凝素相關(guān)外膜蛋白基因的完整核苷酸序列是未知的，因此也就無法獲得純化度較高的壞死 梭桿菌重組血凝素相關(guān)外膜蛋白。目前，迫切需要獲得壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基 因完整的核苷酸序列，這樣才能對其進行表達獲得純化度較高的壞死梭桿菌重組血凝素相 關(guān)外膜蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了填補壞死梭桿菌重組血凝素相關(guān)外膜蛋白的空白，本發(fā)明提供一種壞死梭桿 菌重組血凝素相關(guān)外膜蛋白及其制備方法。
[0006]本發(fā)明為解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明提供的壞死梭桿菌重組血凝素相關(guān)外膜蛋白，該蛋白的基因核苷酸序列如 序列表中的SEQ ID N0:6所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0:7所示。
[0008]進一步的，本發(fā)明的壞死梭桿菌重組血凝素相關(guān)外膜蛋白的基因核苷酸序列通過 染色體步移方法克隆得到。
[0009] 本發(fā)明還提供一種壞死梭桿菌重組血凝素相關(guān)外膜蛋白的制備方法，該方法的條 件和步驟如下：
[0010] 步驟一、采用染色體步移方法對壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基因未知序列進 行克隆和測序
[0011] (1)根據(jù)公布號為AF529887. 1的壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基因部分核苷 酸序列，設(shè)計引物：
[0012]SP1:5'-GCCCCGACTTTGATGTTTCCACTACT-3'，
[0013]SP2 :5'-GCGGGCGGTTCAAATGTTACAGTTCC-3'，
[0014]SP3 :5'-CCGCCGTCGTATTCTTAACTGCCGTTA-3'，
[0015]SP4 :5,-CGCCCCAGACGGATTGGAACAACGAT-3,，
[0016]SP5 :5'-GGCGGGGAAGAATGGGATACCAAGTC-3'，
[0017] SP6 :5'-CGCAACGGATACTGCTGGAGTCATGG-3' ；
[0018] (2)以 FN(AB)的基因組DNA 為模板，Genome Walking kit 中的簡并引物 AP1、AP2、 AP3、AP4分別為上游引物，SP1為第一輪PCR的下游引物，SP2為第二輪PCR的下游引物， SP3為第三輪PCR的下游引物，經(jīng)過三輪PCR擴增壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基因5' 端未知序列，第一輪PCR擴增的反應(yīng)體系總體積為50 y L，包括1 y L FN(AB)的基因組DNA， 8 u L 濃度為 2. 5mmol/L each 的 dNTPs Mixture，5 u L 含 Mg2+plus 的 10 X LAPCRBuffer， 〇. 5 ii L濃度為5U/ ii L的LA Taq，1 ii L濃度為lOOpmo/ ii L的上游引物，1 ii L濃度為lOpmo/ U L的下游引物,33. LddH20 ;第二輪PCR擴增的反應(yīng)體系總體積為50ii L,包括1 ii L第 一輪 PCR 擴增產(chǎn)物，8iiL 濃度為 2.5mmol/L each 的 dNTPs ]\^1忉代，51^含]\%、1118的 10XLAPCRBuffer，0. 5 ii L 濃度為 5U/ ii L 的 LATaq，1 ii L 濃度為 lOOprno/ ii L 的上游引物， 1 U L濃度為10pmo/ ii L的下游引物，33. 5 ii LddH20 ;第三輪PCR擴增的反應(yīng)體系總體積為 50iiL，包括 liiL 第二輪 PCR 擴增產(chǎn)物，8iiL 濃度為 2.5mmol/L each 的 dNTPs Mixture， 5 ii L 含 Mg2+plus 的 10 X LAPCR Buffer，0? 5 ii L 濃度為 5U/ ii L 的 LA Taq，1 ii L 濃度為 lOOprno/ ii L的上游引物，1 ii L濃度為10pmo/ ii L的下游引物，33. 5 ii LddH20 ;PCR反應(yīng)條 件見【具體實施方式】實施例1中的表3 ;膠回收目的片段，連接pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E.coli Trans T1感受態(tài)細胞，通過藍白斑篩選陽性克隆，對PCR鑒定為陽性的菌液進行測 序，測序后拼接為1248bp的核苷酸序列，該未經(jīng)驗證的壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基 因5'端未知核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO: 1所不；
[0019] (3)以FN(AB)的基因組DNA為模板，SP4為第一輪PCR的上游引物，SP5為第二輪 PCR的上游引物，SP6為第三輪PCR的上游引物，Genome Walking kit中的簡并引物API、 AP2、AP3、AP4分別為下游引物，經(jīng)過三輪PCR擴增壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基因3' 端未知序列，第一輪PCR擴增的反應(yīng)體系總體積為50 y L，包括1 y L FN(AB)的基因組DNA， 8 u L 濃度為 2. 5mmol/L each 的 dNTPs Mixture，5 u L 含 Mg2+plus 的 10 X LAPCRBuffer， 〇. 5 ii L濃度為5U/ ii L的LA Taq，1 ii L濃度為lOOprno/ ii L的上游引物，1 ii L濃度為10pmo/ U L的下游引物,33. LddH20 ;第二輪PCR擴增的反應(yīng)體系總體積為50ii L,包括1 ii L第 一輪 PCR 擴增產(chǎn)物，8iiL 濃度為 2.5mmol/L each 的 dNTPs ]\^1忉代，51^含]\%、1118的 10 X LAPCR Buffer，0? 5 ii L 濃度為 5U/ ii L 的 LA Taq，1 ii L 濃度為 lOOprno/ ii L 的上游引物， 1 U L濃度為10pmo/ ii L的下游引物，33. 5 ii LddH20 ;第三輪PCR擴增的反應(yīng)體系總體積為 50iiL，包括 liiL 第二輪 PCR 擴增產(chǎn)物，8iiL 濃度為 2.5mmol/L each 的 dNTPs Mixture， 5 ii L含Mg2+plus 的 10 X LAPCRBuffer，0? 5 ii L濃度為 5U/ii L 的 LA Taq，1 ii L濃度為 lOOpmo/ U L的上游引物，1 ii L濃度為lOpmo/ ii L的下游引物，33. 5 ii LddH20 ;PCR反應(yīng)條件見具體實 施方式實施例1中的表5 ;膠回收目的片段，連接pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli Trans T1感受態(tài)細胞，通過藍白斑篩選陽性克隆，對PCR鑒定為陽性的菌液進行測序，測序后拼接 為1023bp的核苷酸序列，該未經(jīng)驗證的壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基因3'端未知核 苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示；
[0020] 步驟二、壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基因未知序列的驗證
[0021] (1)根據(jù)步驟一的測序結(jié)果，設(shè)計引物：
[0022] jl :5,-TAGTCGAGTGAGATGAAGCAAGCGGAG-3,，
[0023] J2 :5'-CCCGCCGAGTGAGATGAAACGAGTAC-3' ；
[0024] (2)壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基因5'端未知序列的驗證
[0025] 以FN(AB)的基因組DNA為模板，jl為上游引物，SP3為下游引物，采用高保真的 FastPfu DNA聚合酶進行PCR擴增壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基因的5'端未知序列； PCR反應(yīng)體系見表4, PCR反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，61°C退火30s，72°C延 伸50s，30次循環(huán)，72°C延伸10min，4°C終止反應(yīng)；膠回收目的片段，連接pEASY-Blunt載 體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli Trans T1感受態(tài)細胞，對PCR鑒定正確的菌液進行測序，測序后 拼接為1248bp的核苷酸序列，該經(jīng)過驗證的壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基因5'端未 知核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0:3所示；
[0026] (3)壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基因3'端未知序列的驗證
[0027] 以FN(AB)的基因組DNA為模板，SP6為上游引物，j2為下游引物，采用高保真 的FastPfu DNA聚合酶進行PCR擴增壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基因的3'端未知 序列，PCR反應(yīng)體系總體積為50 ii L,包括2 ii L模板,2 ii L濃度為10μmol/L的上游引物， 2uL 濃度為 lOumol/L 的下游引物，lOuL 5XTransStart FastPfu Buffer, 5iiL 濃度為 2. 5mmol/L each 的 dNTPs Mixture，1 u L 高保真的 FastPfu DNA 聚合酶，28 u L ddH20, PCR 反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸50s，30次循環(huán)，72°C 延伸10min，4°C終止反應(yīng)；膠回收目的片段，連接pEASY-Blunt載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli Trans T1感受態(tài)細胞，對PCR鑒定正確的菌液進行測序，測序后拼接為1000bp的核苷酸序 列，該經(jīng)過驗證的壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列如序列表中 的 SEQ ID N0:4 所示；
[0028] (4)經(jīng)過驗證的壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基因5'端未知序列與3'端未知 序列的拼接與分析
[0029] 經(jīng)過驗證的壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列總長度為 1248bp，與公布號為AF529887. 1的壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基因部分核苷酸序列 重疊174個堿基，經(jīng)過驗證的壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列總 長度為l〇〇〇bp，與公布號為AF529887. 1的壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基因部分核苷 酸序列重疊272個堿基，根據(jù)重疊的核苷酸序列，將經(jīng)過驗證的壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外 膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列、公布號為AF529887. 1的壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋 白基因部分核苷酸序列和經(jīng)過驗證的壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基因3'端未知核苷 酸序列拼接在一起，得到總長度為4247bp的核苷酸序列，如序列表中的SEQ ID N0:5所示；
[0030] 利用NCBI在線工具預(yù)測4247bp核苷酸序列的開放閱讀框，預(yù)測結(jié)果為4