復(fù)合型piggyBac重組載體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種piggyBac重組載體及其制備方法，還涉及該 重組載體在制備穩(wěn)定、可置換型高效轉(zhuǎn)基因家蠶表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 自1982年第一例利用P因子在黑腹果蠅中介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)昆蟲遺傳轉(zhuǎn)化報(bào)道以來，基于 轉(zhuǎn)座子的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)已經(jīng)在過去的30多年被廣泛用于昆蟲和其他無脊椎動(dòng)物的基礎(chǔ)與 應(yīng)用研宄。其中，應(yīng)用最為廣泛與成熟的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是來源于粉紋夜蛾（Trichoplusia ni) 的piggyBac轉(zhuǎn)座子。piggyBac是一種典型的II型轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，其內(nèi)部區(qū)域序列編碼1個(gè) 含594個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)座酶。該轉(zhuǎn)座酶可作用于piggyBac轉(zhuǎn)座子兩端的末端反向重復(fù)序列 (Terminal inverted repeat，TIR)及其臨近的DNA序列，進(jìn)而介導(dǎo)piggyBac轉(zhuǎn)座子從原 位點(diǎn)切除，然后整合至一個(gè)新的含有保守的"TTAA"序列的宿主基因組位點(diǎn)。piggyBac轉(zhuǎn)座 子的一個(gè)缺點(diǎn)在于，其介導(dǎo)外源基因在宿主染色體的插入位置或插入拷貝數(shù)不同，會(huì)導(dǎo)致 外源基因的表達(dá)受到位置效應(yīng)的影響，并且可能導(dǎo)致宿主自身所含基因的突變失活，即存 在插入突變現(xiàn)象。而利用位點(diǎn)特異性重組（Site-specific recombination，SSR)技術(shù)則能 夠有效克服轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的外源基因在基因組隨機(jī)整合而不具有靶向性和易受整合的位置 效應(yīng)影響等缺點(diǎn)。
[0003] 位點(diǎn)特異性重組技術(shù)是目前實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)插入與定點(diǎn)敲除最有效的手段之一。其 作為一項(xiàng)十分有效的、高靶向性的基因功能研宄和遺傳改造的方法體系，已被廣泛應(yīng)用于 擬南芥、小鼠、果蠅等多種模式生物，正逐漸成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物研宄領(lǐng)域進(jìn)行基因操作的強(qiáng) 有力工具。目前最常用的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)包括FLP/FRT、Cre/loxP和phiC31/att系 統(tǒng)等。鏈霉菌噬菌體phiC31整合酶作為絲氨酸重組酶家族的成員，可催化細(xì)菌附著位點(diǎn) (attB位點(diǎn)）和菌體附著位點(diǎn)（attP位點(diǎn)）間發(fā)生有效的單向性重組。attB位點(diǎn)和attP 位點(diǎn)的最小長度分別為34bp和39bp，attB位點(diǎn)和attP位點(diǎn)重組后產(chǎn)生attL和attR 2個(gè) 不同序列的重組位點(diǎn)。在沒有輔因子的情況下，phiC31整合酶無法再介導(dǎo)attL和attR位 點(diǎn)間發(fā)生重組反應(yīng)。這種不可逆的重組以及較短重組位點(diǎn)的特點(diǎn)吸引了許多研宄者進(jìn)一步 研宄phiC31整合酶在高等真核生物遺傳工程的潛在應(yīng)用價(jià)值。
[0004] 家蠶是目前世界上人類利用得最成功和最悠久的經(jīng)濟(jì)昆蟲之一，作為一種相當(dāng)重 要的鱗翅目模式生物，具有深入研宄的重要價(jià)值和意義。隨著家蠶基因組框架圖、精細(xì)圖 和遺傳突變圖譜的完成，家蠶基因組研宄已逐步進(jìn)入功能基因組時(shí)代?；赑iggyBac轉(zhuǎn) 座子系統(tǒng)建立轉(zhuǎn)基因家蠶來開展基因的功能研宄，已經(jīng)成為目前家蠶功能基因研宄領(lǐng)域最 重要的技術(shù)手段之一。家蠶也是目前應(yīng)用piggyBac轉(zhuǎn)座子最為廣泛和相對(duì)最為成熟的非 果蠅屬昆蟲物種。然而，目前利用PiggyBac介導(dǎo)外源基因在家蠶基因組中的隨機(jī)整合所 帶來的位置效應(yīng)和插入突變現(xiàn)象給家蠶基因功能研宄帶來了許多不良影響，例如不可預(yù)知 的基因表達(dá)的變化、破壞宿主基因的結(jié)構(gòu)、影響轉(zhuǎn)基因家蠶的正常生長發(fā)育等。并且，由于 piggyBac介導(dǎo)外源基因整合的隨機(jī)性，單純利用piggyBac轉(zhuǎn)座子幾乎不可能重復(fù)多次介 導(dǎo)不同外源基因在某個(gè)確定的靶位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)整合。而如前所述，如果能夠利用phiC31/ att位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)介導(dǎo)外源基因在已經(jīng)確定的家蠶基因組靶位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)整合和替 換，將能夠有效克服piggyBac介導(dǎo)外源基因隨機(jī)插入的缺點(diǎn)。
[0005] 利用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)建立轉(zhuǎn)基因昆蟲的另一個(gè)潛在問題在于，通過轉(zhuǎn)座載體介導(dǎo)插入 宿主基因組的轉(zhuǎn)基因存在整合后不穩(wěn)定現(xiàn)象。目前已經(jīng)在包括黑腹果蠅、赤擬谷盜、地中 海實(shí)蠅、斯氏按蚊和家蠶在內(nèi)的多種昆蟲物種中觀察到了 piggyBac在宿主基因組中的再 轉(zhuǎn)座現(xiàn)象。宿主基因組中含有具有轉(zhuǎn)錄活性的piggyBac-like序列，能編碼生成具有活 性的內(nèi)源性轉(zhuǎn)座酶，是產(chǎn)生這種PiggyBac再轉(zhuǎn)座現(xiàn)象的一個(gè)很重要原因。家蠶基因組中 已經(jīng)鑒定到超過100條piggyBac-like序列，其中許多序列已證實(shí)均具有轉(zhuǎn)錄活性。利 用piggyBac轉(zhuǎn)座子插入宿主基因組后的再轉(zhuǎn)座，實(shí)現(xiàn)piggyBac單側(cè)或兩側(cè)包含末端重復(fù) 序列的轉(zhuǎn)座子臂序列的刪除，是一種消除PiggyBac轉(zhuǎn)座子整合后不穩(wěn)定現(xiàn)象的有效策略。 2004年，Handler等構(gòu)建了含有3個(gè)轉(zhuǎn)座子臂的復(fù)合型piggyBac轉(zhuǎn)座載體，利用piggyBac 的插入后再轉(zhuǎn)座，使得整合進(jìn)入黑腹果蠅基因組的外源DNA片段僅保留了單側(cè)的1個(gè)轉(zhuǎn)座 子臂序列，從而實(shí)現(xiàn)了靶基因在黑腹果蠅基因組的穩(wěn)定整合而不再發(fā)生再轉(zhuǎn)座事件。2006 年，Dafa'alia等對(duì)piggyBac轉(zhuǎn)座載體進(jìn)行了進(jìn)一步改進(jìn)，他們同樣通過利用piggyBac的 插入后再轉(zhuǎn)座，實(shí)現(xiàn)了除靶基因以外的所有PiggyBac轉(zhuǎn)座子序列的刪除，從而確保了靶基 因在地中海實(shí)蠅基因組中的穩(wěn)定整合。但是，這種通過刪除piggyBac兩側(cè)臂序列來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn) 基因穩(wěn)定整合的策略目前尚未應(yīng)用于家蠶和其他的鱗翅目昆蟲物種。
[0006] 因此，結(jié)合位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)、優(yōu)化的piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)以及轉(zhuǎn)基因家蠶外源 蛋白表達(dá)系統(tǒng)，探索一種創(chuàng)制穩(wěn)定、可置換型高效轉(zhuǎn)基因家蠶表達(dá)系統(tǒng)的通用且有效的方 法，將為有效消除插入位置效應(yīng)以及潛在的插入突變和整合后不穩(wěn)定現(xiàn)象對(duì)基因表達(dá)的影 響，為家蠶的基因功能研宄、不同蛋白表達(dá)研宄等提供良好的基礎(chǔ)，同時(shí)這也是推動(dòng)家蠶功 能基因組研宄發(fā)展的需要和必然。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種復(fù)合型piggyBac重組載體，該重組載體可在介 導(dǎo)外源目的基因整合后實(shí)現(xiàn)所有轉(zhuǎn)座子序列和篩選標(biāo)記基因序列從家蠶基因組中完全刪 除，僅在家蠶基因組中保留外源目的基因，并可借助phiC31/att系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)其它外源基因在 家蠶基因組的定點(diǎn)替換；本發(fā)明的目的之二在于提供一種所述復(fù)合型PiggyBac重組載體 的制備方法，操作簡便；本發(fā)明的目的之三在于提供所述復(fù)合型PiggyBac重組載體在制備 穩(wěn)定、可置換型高效轉(zhuǎn)基因家蠶表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之四在于提供一種利用 所述復(fù)合型PiggyBac重組載體制備穩(wěn)定、可置換型高效轉(zhuǎn)基因家蠶表達(dá)系統(tǒng)的方法，該方 法可以實(shí)現(xiàn)除外源目的基因以外的所有轉(zhuǎn)座子序列和篩選標(biāo)記基因序列在家蠶基因組中 完全刪除，確保外源目的基因在家蠶基因組中穩(wěn)定整合而不發(fā)生再轉(zhuǎn)座事件，所得轉(zhuǎn)基因 家蠶表達(dá)系統(tǒng)還可以通過基于phiC31/att系統(tǒng)的phiC31整合酶介導(dǎo)的盒式交換（RMCE) 反應(yīng)實(shí)現(xiàn)其它外源基因在相同整合位點(diǎn)的定點(diǎn)替換。
[0008] 具體技術(shù)方案如下：
[0009] 1.復(fù)合型piggyBac重組載體，在野生型piggyBac轉(zhuǎn)座子臂R1和L1之間插入了 外源目的基因表達(dá)框、篩選標(biāo)記基因表達(dá)框I和II、由熱激啟動(dòng)子調(diào)控的PiggyBac轉(zhuǎn)座酶 (PBase)表達(dá)框、以及截短型piggyBac轉(zhuǎn)座子臂L2和R2 ;所述外源目的基因表達(dá)框的兩端 錨定有2個(gè)同向排列的phiC31整合酶識(shí)別位點(diǎn)（attP位點(diǎn)），形成attP-外源目的基因表 達(dá)框-attP序列；所述截短型piggyBac轉(zhuǎn)座子臂L2正向排列于attP-外源目的基因表達(dá) 框-attP序列的5'端；所述截短型piggyBac轉(zhuǎn)座子臂R2反向排列于attP-外源目的基因 表達(dá)框-attP序列的3'端；所述篩選標(biāo)記基因表達(dá)框I位于野生型piggyBac轉(zhuǎn)座子臂R1 和截短型piggyBac轉(zhuǎn)座子臂L2之間；所述篩選標(biāo)記基因表達(dá)框II位于截短型piggyBac 轉(zhuǎn)座子臂R2和野生型piggyBac轉(zhuǎn)座子臂L1之間；所述piggyBac轉(zhuǎn)座酶表達(dá)框排列于篩 選標(biāo)記基因表達(dá)框II之后，同樣位于轉(zhuǎn)座子臂R2和L1之間；所述野生型piggyBac轉(zhuǎn)座子 臂R1的序列如SEQ ID No. 1所示，野生型piggyBac轉(zhuǎn)座子臂L1的序列如SEQ ID No. 2所 示，截短型piggyBac轉(zhuǎn)座子臂L2的序列如SEQ ID No. 3所示，截短型piggyBac轉(zhuǎn)座子臂 R2的序列如SEQ ID No. 4所示，截短型piggyBac轉(zhuǎn)座子臂L2和R2序列的3'端還分別含 有TTAA位點(diǎn)。
[0010] 優(yōu)選的，所述外源目的基因表達(dá)框是以絲腺特異型啟動(dòng)子啟動(dòng)的熒光蛋白表達(dá) 框。
[0011] 更優(yōu)選的，所述外源目的基因表達(dá)框是以家蠶絲素重鏈啟動(dòng)子（FibH)啟動(dòng)的增 強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP)表達(dá)框。
[0012] 優(yōu)選的，所述篩選標(biāo)記基因表達(dá)框I和II是以組織特異型啟動(dòng)子啟動(dòng)的熒光標(biāo)記 基因表達(dá)框。
[0013] 更優(yōu)選的，所述篩選標(biāo)記基因表達(dá)框I是以眼和神經(jīng)特異表達(dá)啟動(dòng)子3XP3啟動(dòng) 的紅色熒光蛋白（DsRed)表達(dá)框；所述篩選標(biāo)記基因表達(dá)框II是以3XP3啟動(dòng)子啟動(dòng)的 EGFP表達(dá)框。
[0014] 優(yōu)選的，所述熱激啟動(dòng)子為黑腹果蠅hsp70基因啟動(dòng)子。
[0015] 在本發(fā)明的復(fù)合型piggyBac重組載體中，除了以FibH啟動(dòng)EGFP基因在家蠶絲腺 中特異表達(dá)，并與絲素重鏈融合表達(dá)的FibH-EGFP表達(dá)框外，其它外源目的基因表達(dá)框同 樣適用；除了以3 X P3啟動(dòng)子啟動(dòng)的DsRed表達(dá)框和以3 X P3啟動(dòng)子啟動(dòng)的EGFP表達(dá)框 外，其它篩選標(biāo)記基因表達(dá)框同樣適用；除了 FibH、3 X P3啟動(dòng)子、黑腹果蠅hsp70基因啟動(dòng) 子外，其它絲腺特異型啟動(dòng)子（如絲素輕鏈基因FibL、P25蛋白基因fhx/P25和絲膠1基因 Seri啟動(dòng)子）、組織特異型啟動(dòng)子（如脂肪體、中腸和血液特異型啟動(dòng)子）、熱激啟動(dòng)子也能 夠按照本發(fā)明提供的策略用于構(gòu)建復(fù)合型PiggyBac重組載體。
[0016] 2.復(fù)合型piggyBac重組載體的制備方法，包括以下步驟：
[0017] a.采用上游引物attP-R2-F_SpeI和下游引物R2-R_XhoI，以 pBac {3XP3_DsRedaf}載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到attP_pBacR2片段，經(jīng)Spel和Xhol 雙酶切后連入口31{3\?346??-5￥40}載體，得到口51{3??-1?2-3\?346??-5￥40}重組載 體；所述上游引物attP-R2-F-SpeI的序列如SEQ ID No. 5所示，下游引物R2-R-XhoI的序 列如SEQ ID No. 6所示；
[0018] b.采用上游引物 SV40-F-NotI 和下游引物 SV40-R-SphI，以pBac{3XP3-DsRedaf} 載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SV40polyA片段，經(jīng)Notl和SphI雙酶切后連入pSLfall80fa 載體，得到pSL-SV40polyA重組載體；