一種重組載體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組載體及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4 (CTLA4)是T淋巴細(xì)胞表面的受體，是抑制T細(xì) 胞活化的共刺激分子，當(dāng)T細(xì)胞表面受體CTLA4與APC上的B7分子結(jié)合后，會(huì)抑制T細(xì)胞 的活化，從而抑制T細(xì)胞的過度活化。很多過度免疫反應(yīng)引發(fā)的疾病均與CTLA4蛋白的低 表達(dá)有著極為密切的關(guān)系，如同種異體移植引發(fā)的免疫排斥反應(yīng)、慢性支氣管哮喘、風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎（RA)、艾滋病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、內(nèi)毒素性休克病等疾病，因此CTLA4蛋白或 融合蛋白在這些疾病的特異性治療方面有著十分廣闊的應(yīng)用前景。此外，CTLA4蛋白在機(jī) 體內(nèi)的過度表達(dá)與很多疾病特別是腫瘤有著密切的關(guān)系，如黑色素瘤、白血病、部分胃癌和 食道癌、利什曼病等。CTLA4的單克隆抗體CTLA4mAb可廣泛用于抗腫瘤的免疫治療，是目前 腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)及方向。獲得具有生物學(xué)功能、接近人類天然CTLA4蛋白的重組 蛋白是CTLA4特異性治療疾病的關(guān)鍵。
[0003] 因此，有必要提供一種在真核細(xì)胞中表達(dá)CTLA4重組蛋白的表達(dá)載體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述問題，本發(fā)明第一方面提供了一種重組載體，所述重組載體為酵母分 泌表達(dá)載體pPICZaA的重組載體，該重組載體含有人源CTLA4胞外區(qū)基因，可用于表達(dá)人源 CTLA4融合蛋白。該重組載體還含有Kex2蛋白酶酶切位點(diǎn)、His標(biāo)簽和c-myc標(biāo)簽，可使得 表達(dá)的CTLA4融合蛋白以分泌蛋白的形式釋放到胞外，并對(duì)蛋白進(jìn)行純化，為CTLA4蛋白的 工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種簡便的方法。本發(fā)明第二方面提供了一種重組菌，該重組菌包含第 一方面所述的重組載體。本發(fā)明第三方面提供了一種重組載體的制備方法。本發(fā)明第四方 面提供了一種基因，所述基因是核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示的DNA分子。本發(fā)明第五 方面提供了一種重組載體的應(yīng)用。
[0005] 第一方面，本發(fā)明提供了一種重組載體，包含如SEQ ID N0 :1所示的基因，所述重 組載體為重組pPICZaA質(zhì)粒，所述基因插入所述pPICZaA質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明采用的pPICZaA質(zhì)粒含有His標(biāo)簽(組氨酸標(biāo)簽）和c-myc標(biāo)簽，能使表達(dá) 后的蛋白帶上這兩種標(biāo)簽，His標(biāo)簽有利于表達(dá)后融合蛋白的分離純化，c-myc標(biāo)簽有利于 融合蛋白在實(shí)驗(yàn)中的分析和追蹤，比如用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)時(shí)的分析。
[0007] 優(yōu)選地，如第一方面所述的基因插入pPICZaA質(zhì)粒的Xho I和Xba I位點(diǎn)。
[0008] 第二方面，本發(fā)明提供了一種重組菌，包含如第一方面所述的重組載體，所述重組 菌為重組畢赤酵母GS115菌株。
[0009] 本發(fā)明提供的如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列包括Kex2蛋白酶酶切位點(diǎn)的編 碼序列和CTLA4胞外區(qū)的編碼序列（Gene Bank克隆號(hào)：NM-005214. 3)。
[0010] Kex2蛋白酶位于酵母細(xì)胞膜中，是a-factor信號(hào)肽的切割酶，它能有效識(shí)別酶 切位點(diǎn)Lys-Arg，通過對(duì)酶切位點(diǎn)之前的信號(hào)肽的切割而得到天然N端的CTLA4蛋白（由于 本發(fā)明提供的Kex2酶切位點(diǎn)的上游是質(zhì)粒的Xho I位點(diǎn)，下游緊鄰CTLA4蛋白胞外區(qū)序 列，因此，切割后能得到天然的N端CTLA4蛋白胞外區(qū)；該天然N端是指在CTLA4蛋白胞外 區(qū)的N端不含有其它任何多余系列）。
[0011]本發(fā)明提供的如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列在酵母中表達(dá)后，能得到含有Kex2蛋白酶酶切位點(diǎn)的CTLA4胞外區(qū)融合蛋白，該Kex2蛋白酶酶切位點(diǎn)經(jīng)酵母細(xì)胞膜的 Kex2蛋白酶切割，促使CTLA4胞外區(qū)融合蛋白分泌到胞外。
[0012] 第三方面，本發(fā)明提供了一種如第二方面所述的重組載體的制備方法，包括如下 步驟：
[0013] (1)、設(shè)計(jì)CTLA4基因胞外區(qū)片段的上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引 物的堿基序列分別如SEQIDN0:2和SEQIDN0:3所示；
[0014] (2)、提供或制備CTLA4基因模板，并以步驟（1)所得上游引物和下游引物為PCR引 物，擴(kuò)增CTLA4基因胞外區(qū)片段；
[0015](3)、取pPICZaA質(zhì)粒，將步驟（2)擴(kuò)增得到的CTLA4基因胞外區(qū)片段和所述 pPICZaA質(zhì)粒利用相同的內(nèi)切酶分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，純化回收后進(jìn)行連接，得到所述重組 載體。
[0016] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中，所述CTLA4基因模板為含有CTLA4基因的重組載體 PGEM-T-CTLA4。
[0017] 本發(fā)明采用的pGEM-T-CTLA4質(zhì)粒含有人CTLA4基因全長ORF (Gene Bank克隆號(hào) 為 NM-005214. 3)
[0018] 優(yōu)選地，所述步驟（3)中，所述雙酶切反應(yīng)所采用的內(nèi)切酶為XhoI內(nèi)切酶和Xba I內(nèi)切酶。
[0019] 所述如SEQIDN0:2所示的上游引物具體為：
[0020] 5, -CCGCTCGAGAAAAGAAAAGCAATGCACGTGGCC-3'
[0021] 所述如SEQIDN0:3所示的下游引物具體為：
[0022] 5, -GCTCTAGAGCGTCAGAATCTGGGCACGGTT-3'
[0023] 該上游引物（CTLA4up)和下游引物（CTLA4down)的組成如下：
[0024；
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組載體，其特征在于，包含如SEQ ID NO :1所示的基因，所述重組載體為重組 pPICZaA質(zhì)粒，所述基因插入所述pPICZaA質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)。
2. -種重組菌，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述重組載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組菌，其特征在于，所述重組菌為重組畢赤酵母GS115菌 株。
4. 一種如權(quán)利要求1所述的重組載體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 、設(shè)計(jì)CTLA4基因胞外區(qū)片段的上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的 堿基序列分別如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示； (2)、提供或制備CTLA4基因模板，并以步驟（1)所得上游引物和下游引物為PCR引物， 擴(kuò)增CTLA4基因胞外區(qū)片段； (3)、取pPICZaA質(zhì)粒，將步驟（2)擴(kuò)增得到的CTLA4基因胞外區(qū)片段和所述pPICZaA質(zhì) 粒利用相同的內(nèi)切酶分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，純化回收后進(jìn)行連接，得到所述重組載體。
5. 如權(quán)利要求4所述的一種重組載體的制備方法，其特征在于，所述步驟（2)中，所述 CTLA4基因模板為含有CTLA4基因的重組載體pGEM-T-CTLA4。
6. 如權(quán)利要求4所述的一種重組載體的制備方法，其特征在于，所述步驟（3)中，所述 雙酶切反應(yīng)所采用的內(nèi)切酶為Xho I內(nèi)切酶和Xba I內(nèi)切酶。
7. -種基因，其特征在于，所述基因是核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示的DNA分子。
8. 如權(quán)利要求1所述的重組載體在制備免疫或腫瘤疾病藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種重組載體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的重組載體采用酵母分泌表達(dá)載體pPICZaA構(gòu)建，含有人源CTLA4胞外區(qū)基因，可用于表達(dá)人源CTLA4融合蛋白；該重組載體還含有Kex2蛋白酶酶切位點(diǎn)、His標(biāo)簽和c-myc標(biāo)簽，可使得表達(dá)的CTLA4融合蛋白以分泌蛋白的形式釋放到胞外，并對(duì)蛋白進(jìn)行純化，為CTLA4蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種簡便的方法。
【IPC分類】C12N15-66, C12N15-12, C12N1-19, A61P35-00, A61P37-00, C12N15-81, A61K38-17, C12R1-84
【公開號(hào)】CN104673822
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310612966
【發(fā)明人】萬曉春, 陳鳳蓮, 王蒲, 趙琦, 阮慶國
【申請(qǐng)人】深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
【公開日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2013年11月27日