一種單體系測(cè)定糖化白蛋白與白蛋白濃度比值的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種單體系測(cè)定糖化白蛋白與白蛋白濃度 比值的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖化血清白蛋白（GA)是血清白蛋白被葡萄糖糖化之后的產(chǎn)物，即血清白蛋白的 賴氨酸殘基上的e-氨基基團(tuán)被糖化。糖化白蛋白半衰期較短，測(cè)定糖化白蛋白的濃度可 有效反映患者過去2~3周內(nèi)平均血糖的水平，并不受臨時(shí)血糖濃度波動(dòng)的影響。目前，臨 床廣泛采用測(cè)定糖化血清白蛋白（GA)與白蛋白（ALB)濃度的比值（C M/C_)來反映較短期 內(nèi)糖尿病的控制程度。
[0003] 自糖化血清白蛋白對(duì)糖尿病的診斷意義被臨床所認(rèn)識(shí)以來，已有陰離子交換層析 法、高效液相色譜法、糖化氨基酸氧化酶分析法等諸多方法應(yīng)用于血清GA的測(cè)定。前兩種 方法需要對(duì)GA進(jìn)行復(fù)雜的樣品前處理，同時(shí)需特殊、昂貴儀器，不適合臨床常規(guī)分析。糖化 氨基酸氧化酶分析法雖好，但只能單獨(dú)檢測(cè)GA濃度，而不能同時(shí)檢測(cè)ALB濃度，從而無法直 接報(bào)告CM/C_比值。為了彌補(bǔ)此缺點(diǎn)，臨床工作者常采用兩個(gè)獨(dú)立的體系分別檢測(cè)GA和 ALB濃度，即用糖化氨基酸氧化酶分析法測(cè)定GA濃度、用溴甲酚綠或溴甲酚紫比色法測(cè)定 ALB濃度，再進(jìn)一步求出CeA/C_比值。由于用兩個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)體系進(jìn)行測(cè)量時(shí)影響因素多、 變異系數(shù)大，得出的CM/C_比值存在準(zhǔn)確性不佳、重復(fù)性差的缺點(diǎn)。
[0004] 因此，需求一種單體系測(cè)定糖化白蛋白與白蛋白比值（cM/c_)的試劑盒，對(duì)提高 檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為了解決上述技術(shù)的不足，建立一種基于氨基酸氧化酶-過氧化 物酶偶聯(lián)、可單體系測(cè)定CM/CAI^k值的新試劑盒。該試劑盒置2_8°C保存可穩(wěn)定36個(gè)月， 可以應(yīng)用于目前廣泛使用的臨床生化自動(dòng)分析儀，從而達(dá)到大規(guī)模測(cè)定樣本的要求。
[0006] 本發(fā)明的試劑盒具體組成如下：
[0007] 試劑I為含有菠蘿蛋白酶、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺鈉鹽 (T00S)、TritonX-100 的pH7. 0-10.OTris緩沖液；
[0008] 試劑II為含果糖氨基酸氧化酶（FA0D)、過氧化物酶（P0D)、4_氨基安替比林 (4-AAP)、海藻糖的pH7. 0-10.OTris緩沖液為試劑II;
[0009] 試劑III為含氨基酸氧化酶（DA0)、海藻糖的PH7. 0-10.OTris緩沖液。
[0010] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑I中，pH7.00-10.00Tris-HCl濃度為 20-200mmol/L，菠蘿蛋白酶濃度為 30-120KU/L、T00S濃度為 0? 5-5mmol/L、TritonX-100 濃 度為 0. 5-10ml/L。
[0011]所述試劑II中，7. 0-10.OTris-HCl濃度為 20-200mmol/L，F(xiàn)A0D濃度為 20-100KU/L，P0D濃度為 5-30KU/L，4-AAP濃度為 1. 0-3. 0mmol/L、海藻糖濃度為 10-50g/L。
[0012] 所述試劑III中，7. 0-10.0 Tris-HCl 濃度為 20-200mmol/L，DAO 濃度為 200-500KU/ L，海藻糖濃度為10_50g/L。
[0013] 在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑I中，pH 8. 0-9. OTris-HCl濃度為 100-150mmol/L，菠蘿蛋白酶濃度為 60-90KU/L、T00S 濃度為 2-4mmol/L、TritonX-100 濃度 為 4_6ml/L。
[0014] 所述試劑 II 中，8. 0-9. OTris-HCl 濃度為 100-150mmol/L，F(xiàn)A0D 濃度為 40-80KU/ L，P0D 濃度為 15-20KU/L，4-AAP 濃度為 1. 0-3. Ommol/L、海藻糖濃度為 20-40g/L。
[0015] 所述試劑III中，8. 0-9.OTris-HCl濃度為 100-150mmol/L，DA0 濃度為 300-400KU/ L，海藻糖濃度為20-40g/L。
[0016] 在本發(fā)明進(jìn)一步地實(shí)施方案中，所述試劑I中，菠蘿蛋白酶的濃度為75KU/L、T00S 濃度為 2. 75mmol/L、TritonX-100 的濃度為 5. 25ml/L、pH8. 5Tris-HCl 緩沖液的濃度為 110mmol/L ；
[0017] 所述試劑 II 中，F(xiàn)A0D濃度為 60KU/L、P0D濃度為 17. 5KU/L、4-AAP濃度為 2. Ommol/ L、海藻糖濃度為30g/L、pH8. 5Tris-HCl緩沖液的濃度為110mmol/L ;
[0018] 所述試劑III中，DA0濃度為350KU/L、海藻糖濃度為30g/L、pH 8. 5Tris-HCl緩沖 液的濃度為110mm〇l/L。
[0019] 本發(fā)明試劑盒的測(cè)定原理為：
[0020] 第一步，配制含有菠蘿蛋白酶、N-乙基-N_(2-羥基-3-磺丙基）_3_甲基苯胺鈉 鹽（T00S)、聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100)的pH7. 0-10.0三羥甲基氨基甲烷（Tris) 緩沖液為試劑I，按一定比例加入含糖化白蛋白和白蛋白的血清樣本。在TritonX-100的 存在下，菠蘿蛋白酶將血清樣本中的糖化白蛋白（GA)和白蛋白（ALB)迅速降解為果糖氨基 酸、甘氨酸等氨基酸混合物；
[0021] 第二步，配制含果糖氨基酸氧化酶（FA0D)、過氧化物酶（P0D)、4_氨基安替比林 (4-AAP)、海藻糖的pH7. 0-10. 0三羥甲基氨基甲烷（Tris)緩沖液為試劑II，將試劑II按一 定比例加入到第一步試劑I和待測(cè)血清樣品的混合溶液中。第一步反應(yīng)中生成的果糖氨基 酸被果糖氨基氧化酶所氧化產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫再在過氧化物酶的作用下與4-氨基 安替比林和N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺鈉鹽反應(yīng)生成紫紅色化合物，檢 測(cè)540nm的吸光度值A(chǔ)i，與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照后計(jì)算出糖化白蛋白濃度C M;
[0022] 第三步，配制含氨基酸氧化酶（DA0)、海藻糖的pH7. 0-10. 0三羥甲基氨基甲烷 (Tris)緩沖液為試劑III，將試劑III按一定比例加入到第二步反應(yīng)所得的混合溶液中?；旌?溶液中的氨基酸被氨基酸氧化酶反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫再在過氧化物酶的作用下與 4_氨基安替比林和N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺鈉鹽反應(yīng)生成紫紅色化 合物，引起540nm處的吸光度值上升，檢測(cè)540nm的吸光度值A(chǔ) 2，與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照后計(jì)算出白蛋 白濃度C_;第四步，將第二步所測(cè)得的糖化白蛋白濃度CM除以第三步所測(cè)得白蛋白濃度 Cg得血清c eA/c_比值。
[0023] 本發(fā)明還提供了采用本發(fā)明試劑盒測(cè)定糖化白蛋白與白蛋白比值（CM/C_)的方 法，其包括以下步驟：
[0024](1)、配制含有菠蘿蛋白酶、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺鈉鹽 (T00S)、聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100)的pH7. 0-10.0三羥甲基氨基甲烷（Tris)緩 沖液為試劑I，按一定比例加入含糖化白蛋白和白蛋白的血清樣本；
[0025] (2)、配制含果糖氨基酸氧化酶（FA0D)、過氧化物酶（P0D)、4_氨基安替比林 (4-AAP)、海藻糖的pH7. 0-10. 0三羥甲基氨基甲烷（Tris)緩沖液為試劑II，將試劑II按一 定比例加入到第一步試劑I和待測(cè)血清樣品的混合溶液中，檢測(cè)540nm的吸光度值A(chǔ) u;1，與 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照后計(jì)算出血清糖化白蛋白濃度CM;
[0026](3)、配制含氨基酸氧化酶（DAO)、海藻糖的pH7. 0-10. 0三羥甲基氨基甲烷（Tris) 緩沖液為試劑III，將試劑III按一定比例加入到第二步反應(yīng)所得的混合溶液中，檢測(cè)540nm 的吸光度值A(chǔ) ，與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照后計(jì)算出白蛋白濃度C_;
[0027] (4)、將第⑵步所測(cè)得的糖化白蛋白濃度CM除以第（3)步所測(cè)得白蛋白濃度 得血清C M/C_比值。
[0028] 步驟（1)中的反應(yīng)條件為在37°C環(huán)境中反應(yīng)180-300秒；
[0029] 步驟⑴中的血清樣本與試劑I的體積比為: x = 5:140 ;
[0030] 步驟（2)中的反應(yīng)條件為在37°C環(huán)境中反應(yīng)180-300秒