組中單一 SSR位點(diǎn)，然 后以EST序列為模板進(jìn)行SSR標(biāo)記的多態(tài)性篩選、驗(yàn)證。充分利用了 EST的冗余性中對(duì)SSR 標(biāo)記篩選驗(yàn)證所需的多態(tài)性，大大提高了 SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)效率，而且對(duì)于全基因組數(shù)據(jù)來(lái) 源較少、實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證時(shí)供試樣本間差異較小，但EST數(shù)據(jù)較豐富的物種EST-SSR標(biāo)記的開(kāi) 發(fā)和防止因供試驗(yàn)證基因組序列或?qū)嶒?yàn)材料遺傳差異不足而淘汰具有潛在利用價(jià)值的SSR 標(biāo)記具有重要作用。
[0018] 由于所開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記均為EST-SSR標(biāo)記，且與單一基因直接關(guān)聯(lián)，因而具有更高 的遺傳與育種應(yīng)有價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1.在EST模版中比對(duì)產(chǎn)物不同長(zhǎng)度差異的馬鈴薯SSR標(biāo)記數(shù)
[0020] 圖2.引物5在20份材料中的擴(kuò)增條帶
【具體實(shí)施方式】
[0021] 本發(fā)明提供的利用全基因組和EST數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記的方法。為使本 發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明確，以下以馬鈴薯為實(shí)例并參照附圖進(jìn)一步詳細(xì) 說(shuō)明。下述實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法，材料和試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均可從商業(yè)途 徑獲得。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0022] 實(shí)施例：馬鈴薯EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證
[0023] 利用全基因組和EST數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)EST-SSR標(biāo)記
[0024] 1. 1獲取馬鈴薯基因組序列和EST數(shù)據(jù)：
[0025]從公共數(shù)據(jù)庫(kù)（http ://solanaceae. plantbiology. msu. edu/)下載馬鈴薯基因 組序列數(shù)據(jù)（PGSC_DM_v3_2. 1. ll_pseudomolecules)與相應(yīng)的基因注釋信息（PGSC_DM_ v3. 4)。從 NCBI (http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/)下載馬鈴薯 EST 數(shù)據(jù)，共 26 萬(wàn)余條（截 至2013年4月）。
[0026] 用基因組注釋信息進(jìn)行外顯子Exon、內(nèi)含子Intron序列分析，選取基因TSS轉(zhuǎn)錄 起始位點(diǎn)前2000bp作為啟動(dòng)子序列。
[0027] 1. 2馬鈴薯基因組SSR位點(diǎn)搜索與分析：
[0028] 采用 MISA程序（http ://pgrc. ipk-gatersleben. de/misa/)掃描馬鈴薯全基因組 12條染色體DNA序列，搜索、分析基因組序列中包含的SSR位點(diǎn)，SSR掃描標(biāo)準(zhǔn)如下：?jiǎn)魏塑?酸重復(fù)（MNRs)、二核苷酸重復(fù)（DNRs)、三核苷酸重復(fù)（TNRs)、四核苷酸重復(fù)（TTRs)、五核苷 酸重復(fù)（PNRs)以及六核苷酸重復(fù)（HNRs)，重復(fù)單元分別大于10、7、6、5、4、4次重復(fù)；距離 l〇〇bp的視為一個(gè)SSR位點(diǎn)；每種重復(fù)基元的各種變異類型及其反向互補(bǔ)類型均歸為一類。 其中12條染色體上搜索到的SSR位點(diǎn)及其染色體分布特征見(jiàn)表1。
[0029] L1N丄A p/J 4/6 JM
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 利用全基因組和EST數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記的方法，其特征在于，包括下述步 驟： ① 獲取基因組序列與EST數(shù)據(jù)，從公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載基因組序列數(shù)據(jù)、相應(yīng)的基因注釋 信息和EST數(shù)據(jù)，用基因組注釋信息進(jìn)行基因組外顯子、內(nèi)含子序列分析，選取基因TSS轉(zhuǎn) 錄起始位點(diǎn)前2000bp作為啟動(dòng)子序列； ② 將步驟①獲得的全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索與分析，采用MISA程序掃描全基因 組染色體DNA序列，搜索、分析基因組序列中包含的SSR位點(diǎn)； ③ 單一 SSR位點(diǎn)篩選，采用Perl編寫(xiě)程序，從每個(gè)SSR結(jié)構(gòu)域前若干堿基對(duì)開(kāi)始，提 取18~24bp的序列作為電子模擬PCR擴(kuò)增的上引物；間隔10~24bp后，提取18~24bp 序列，反向重復(fù)后作為下引物；采用Bowtie軟件將引物序列比對(duì)到步驟①所下載的參考基 因組上，根據(jù)需要允許若干個(gè)堿基的錯(cuò)配；采用Perl語(yǔ)言編寫(xiě)程序，鑒定、篩選單一 SSR位 占. ④ EST中多態(tài)性SSR位點(diǎn)鑒定與分析，采用序列比對(duì)軟件Bowtie以EST序列為模板，以 具有單一側(cè)翼序列的SSR比對(duì)引物進(jìn)行比對(duì)，采用Perl語(yǔ)言編程統(tǒng)計(jì)匹配區(qū)域長(zhǎng)度信息； ⑤ 多態(tài)性EST-SSR位點(diǎn)篩選，篩選EST模板中有2個(gè)以上模擬擴(kuò)增產(chǎn)物，且產(chǎn)物具有多 態(tài)性的EST-SSR位點(diǎn)； ⑥ 多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記引物設(shè)計(jì)，采用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記引物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用全基因組和EST數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記的方法， 其特征在于：所述基因組和EST數(shù)據(jù)為植物基因組和EST數(shù)據(jù)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用全基因組和EST數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記的方法， 其特征在于：所述基因組和EST數(shù)據(jù)為動(dòng)物基因組和EST數(shù)據(jù)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用全基因組和EST數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記的方法， 其特征在于：所述基因組和EST數(shù)據(jù)為微生物基因組和EST數(shù)據(jù)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用全基因組和EST數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記的方法， 其特征在于：所述基因組和EST數(shù)據(jù)為馬鈴薯基因組和EST數(shù)據(jù)。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了利用全基因組和EST數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記的方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明首先獲取基因組序列與EST數(shù)據(jù)；接著在全基因組中搜索SSR位點(diǎn)，并鑒定、篩選基因組單一SSR位點(diǎn)；然后設(shè)計(jì)單一SSR位點(diǎn)比對(duì)引物，以EST序列數(shù)據(jù)為模版進(jìn)行比對(duì)；統(tǒng)計(jì)比對(duì)結(jié)果，篩選在EST模板中有2個(gè)以上模擬擴(kuò)增產(chǎn)物且具有多態(tài)性的SSR位點(diǎn)；最后設(shè)計(jì)多態(tài)性EST-SSR位點(diǎn)引物，得到多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記。利用本發(fā)明開(kāi)發(fā)EST-SSR標(biāo)記高效、簡(jiǎn)便，并且能防止因供驗(yàn)證的基因組序列或?qū)嶒?yàn)材料遺傳差異不足而淘汰掉具有潛在利用價(jià)值的EST-SSR標(biāo)記。所開(kāi)發(fā)的EST-SSR標(biāo)記與單一基因緊密關(guān)聯(lián)，具有更高的遺傳與育種應(yīng)有價(jià)值。
【IPC分類】C12Q1-68, G06F19-22
【公開(kāi)號(hào)】CN104673884
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410235537
【發(fā)明人】楊先泉, 劉堅(jiān), 瞿靜濤, 王西瑤, 劉春雷, 倪蘇, 李立芹, 易游人, 袁娟
【申請(qǐng)人】四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2014年5月24日