加工食品中核桃植物源性成分鑒別用hda引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于加工食品中核桃植物源性成分 鑒別的HDA引物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)前核桃加工食品及飲品增長迅速，受到廣大消費(fèi)者的歡迎。隨之而來的問題是， 在核桃制產(chǎn)品的制備過程中存在大量的不規(guī)范操作，使得所得終產(chǎn)品中核桃源成分的有無 及其含量無法確定，導(dǎo)致核桃食品/飲品的質(zhì)量無法保障。
[0003] 與此同時(shí)，隨著核酸擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，以核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測(cè) 技術(shù)近年來得到了迅猛的發(fā)展。多種機(jī)制的等溫技術(shù)不僅誕生，而且有些技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成 熟，完成了從實(shí)驗(yàn)室到實(shí)際應(yīng)用的過渡，正逐步在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、法學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛 的運(yùn)用。特別是在現(xiàn)場快速檢測(cè)技術(shù)方面，核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)顯示了其突出的優(yōu)越性。更 為重要的是，核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)由于不需要溫度變化的時(shí)間過程且擺脫了對(duì)精良儀器設(shè)備 的依賴，使病原體的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)了快速、簡便和高通量。在實(shí)際操作和儀器要求方面，這些等 溫技術(shù)都比PCR技術(shù)更為簡單和廉價(jià)，從而更容易被開發(fā)成現(xiàn)場檢測(cè)的應(yīng)用產(chǎn)品。因此，等 溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是核酸擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展方向，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0004] 依賴解旋酶 DNA 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Helicase-Dependent isothermal DNA Amplification，簡稱HDA)是由美國NEB公司研宄人員Vincent等于2004年發(fā)明一種新型 核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)模擬體內(nèi)DAN在恒溫下復(fù)制的自然過程，在恒溫條件下利用生 物復(fù)制系統(tǒng)的關(guān)鍵組分實(shí)現(xiàn)DNA的體外擴(kuò)增。主要是利用解旋酶在恒溫下解開DNA雙鏈， 同時(shí)DNA單鏈結(jié)合蛋白（SSB)穩(wěn)定解開的單鏈為引物提供結(jié)合模板，然后由DNA聚合酶催 化合成互補(bǔ)鏈。新合成的雙鏈在解旋酶的作用下又形成單鏈，并作為下一輪合成的模板進(jìn) 入循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)靶序列的指數(shù)增長。
[0005] HDA技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于：等溫?cái)U(kuò)增，在一個(gè)恒定溫度就能完成擴(kuò)增反應(yīng)，不需要像 PCR那樣循環(huán)的溫度變化；原理簡單，HDA技術(shù)模擬自然界DNA的合成方式，原理清晰易懂； 操作簡便，HDA對(duì)引物的設(shè)計(jì)與PCR相似，不需要復(fù)雜的引物設(shè)計(jì)。對(duì)于其他組分也不需要 做任何特殊處理，只需要一個(gè)恒溫裝置即可進(jìn)行反應(yīng)；設(shè)備簡單，HDA不需要復(fù)雜的設(shè)備， 只需要一個(gè)簡單的恒溫器，如果選用室溫可以進(jìn)行反應(yīng)的酶，甚至不需要恒溫器就可進(jìn)行 反應(yīng)。因此，HDA技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0006] 目前尚未見利用HDA法檢測(cè)核桃植物源成分含量的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種加工食品中核桃植物源性成分鑒別用HDA 引物及其應(yīng)用，利用該引物進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，無論檢測(cè)準(zhǔn)度、精度或?qū)Ｒ欢榷际掷硐搿?br>[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0009] 加工食品中核桃植物源性成分鑒別用HDA引物，所述HDA引物為：上游引物：如 SEQ ID NO :1所示；下游引物：如SEQ ID NO :2所示。
[0010] 利用上述HDA引物鑒別加工食品中核桃植物源性成分的方法，該方法包括如下步 驟：
[0011] A、食品中DNA的提取：取待測(cè)食品樣品，采用試劑盒提取其中的DNA，保存?zhèn)溆茫?br>[0012] B、引物設(shè)計(jì)：引物對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)度、精度、專一度起決定作用，直接采用上述 兩條引物；
[0013] C、HDA反應(yīng)體系的建立：HDA反應(yīng)體系包括：5yL10X緩沖液，0. 04ymol dNTPs， 0. 16 umol ATP，10U Bst ploymerase，0.10-0. 30 ug UvrD helicase，1.0-5. Oug T4gp32 或1. 0-6. 0 y g RecA蛋白，25 y M海藻糖，2 y L模板食品DNA，上游引物和下游引物各 20pmol，用 ddH20 補(bǔ)至 50 y L ;
[0014] D、恒溫?cái)U(kuò)增：將反應(yīng)體系放入60-70°C恒溫金屬浴中恒溫?cái)U(kuò)增l_3h ;
[0015] E、結(jié)果檢測(cè)：瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，利用凝膠成像系統(tǒng)成像分析結(jié)果。
[0016] 作為上述檢測(cè)方法的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟A中，食品中DNA提取的具體操 作方法為：如果操作對(duì)象為固體樣品，則經(jīng)液氮研磨成粉末后取0. lg，如果操作對(duì)象是液 體樣品，則經(jīng)冷凍干燥后取粉末0. lg ;所得樣品粉末加入1. 5mL離心管中，加入600 y 1 65 °C預(yù)熱的Buf f erPCB和12 y 1 0 -巰基乙醇，震蕩混勻，置于65 °C水浴25min，間或混 勾，加入等體積的氯仿，充分混勾，12, OOOrpm離心5min，吸取上層水相至一個(gè)干凈的 1. 5ml的離心管中，加入等體積BufferBD，顛倒混勾3-5次，再加等體積的無水乙醇，充 分混勻后用移液器將其全部加入到Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒的吸附柱中， 室溫靜置2min，10, OOOrpm離心lmin，倒掉收集管中廢液，將吸附柱放回收集管中，加入 500 y lPWSolution，10, OOOrpm離心lmin，倒掉收集管中廢液，將吸附柱放回收集管中，加 入500 y 1 WashSolution，10, OOOrpm，離心lmin，倒掉收集管中廢液，將吸附柱放回收集管 中，12, OOOrpm離心2min，取出吸附柱，放入一個(gè)新的1. 5ml離心管中，在吸附膜中央加入 50 y ITEBuffer，靜置3min，12, OOOrpm離心2min，得到的DNA溶液置于-20°C保存或直接用 于后續(xù)步驟。
[0017] 作為上述檢測(cè)方法的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟C中，所述10X緩沖液包括lOOmM 二硫蘇糖醇、350mM Tris-HAc、100mM MgS04和 lmg/mL BSA。
[0018] 作為上述檢測(cè)方法的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟C中，所述反應(yīng)體系中還包括10U的 Phi29嗜溫聚合酶。
[0019] 作為上述檢測(cè)方法的一種優(yōu)選技術(shù)方案，:步驟C中，所述UvrDhelicase的含量為 0. 15 u g〇
[0020] 作為上述檢測(cè)方法的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟C中，所述T4gp32的含量為4. 5 y g， 或者RecA蛋白的含量為3. 0 y g。
[0021] 作為上述檢測(cè)方法的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟D中，將反應(yīng)體系放入65°C恒溫金 屬浴中恒溫?cái)U(kuò)增2h。
[0022] 作為上述檢測(cè)方法的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟E中，吸取5 y L擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1-2% 瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為80-120V，80-100mA，電泳時(shí)間40-50min，置市售凝膠成像系 統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析，檢測(cè)產(chǎn)物。
[0023] 采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于：本發(fā)明是一種簡便、快速的檢測(cè)方法， 操作簡單，覆蓋面廣，能應(yīng)用在檢驗(yàn)的一線，能夠準(zhǔn)確、快速檢測(cè)出待測(cè)食品是否含有核桃 植物源成分，具有準(zhǔn)度高、精度好、專一性強(qiáng)的特點(diǎn)，具體試驗(yàn)數(shù)據(jù)見實(shí)施例6-7。本發(fā)明的 方法可節(jié)約大量的人力物力，具有重大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0024] 圖1為實(shí)施例6所得電泳圖譜，其中，泳道1 :100bp ladder marker，泳道2 : 0. 00001 %樣品，泳道3 :0. 0001 %樣品，泳道4 :0. 001 %樣品，泳道5 :0. 01 %樣品，泳道 6 :0. 1 %樣品，泳道7 :1 %樣品，泳道8 :10%樣品；可見，本發(fā)明所設(shè)計(jì)引物的檢出精度為 0. 0001 %，即每百克樣品中含有0. 0001 g核桃即可檢出。
[0025] 圖2為實(shí)施例7所得電泳圖譜，其中，泳道1 :100bp ladder marker，泳道2 :核桃， 泳道3 :苜蓿樣品，泳道4 :木薯，泳道5 :紅薯，泳道6 :馬鈴薯?？梢姡颂覙悠繁挥行У臄U(kuò) 增出210bp左右長度的目的片段，電泳條帶清晰，無非特異性擴(kuò)增，而其他4組樣品均未產(chǎn) 生電泳條帶，說明沒有基因擴(kuò)增；可見本發(fā)明所設(shè)計(jì)引物的檢出專一度優(yōu)良。
【具體實(shí)施方式】