基因ii型草魚呼腸孤病毒的檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水生動物病毒領(lǐng)域中的疫病診斷技術(shù)，具體涉及基因II型草魚呼腸 孤病毒的RT-LAMP-LFD檢測方法及其檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 草魚出血?。℉emorrhage of Grass Carp)是草魚養(yǎng)殖業(yè)一種嚴重的病毒性出血 病，對草魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成重大威脅，其流行季節(jié)在每年5月初和10月底之間，水溫在20°C開 始流行，最適流行水溫為27°C _30°C，死亡率可達50% -80%，據(jù)不完全統(tǒng)計，每年由于草魚 出血病導(dǎo)致的經(jīng)濟損失達21. 26億元，該病已被中國農(nóng)業(yè)部列入二類動物疫病病種名錄。 該病病原為草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV)，該病毒為中國分離鑒定的第一 株魚類病毒，隸屬于水生呼腸孤病毒屬（Aquareovirus，ARV)，是該屬成員中毒力最強的病 毒，是中國在國際上首次完成全基因序列分析的第一株水生呼腸孤病毒，也是迄今研宄得 最系統(tǒng)深入的水生呼腸孤病毒，該病毒為雙鏈分節(jié)段RNA病毒，基因組分11個節(jié)段。研宄表 明，根據(jù)GCRV分離株基因序列的特征，目前臨床上共存在三種基因型GCRV，包括以GCRV873 為代表的基因I型，以HZ08、⑶108為代表的基因II型，以HGDRV(Genbank中為GCRV104) 為代表的基因III型。
[0003] 大量樣品檢測結(jié)果表明，臨床流行的毒株為I型和II型，在這之中由于基因II型 草魚出血病死亡快，死亡率高，發(fā)病狀態(tài)上表現(xiàn)為腸出血和肌肉出血，外表癥狀不明顯，導(dǎo) 致很難實現(xiàn)該疾病的及時檢測，高死亡率帶來了巨大的經(jīng)濟損失。目前，用于該基因型GCRV 的檢測方法有電鏡法、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR)檢測法、多重RT-PCR方法等。但在 實際檢測工作中，現(xiàn)有的檢測技術(shù)存在以下問題：一是靈敏度不夠，無法檢測到潛伏感染樣 品；二是容易產(chǎn)生假陽性，對模板質(zhì)量要求高；三是操作繁瑣，對實驗條件要求高，不利于 養(yǎng)殖戶和一線生產(chǎn)技術(shù)人員來操作。
[0004] RT-LAMP是核酸等溫擴增檢測技術(shù)，依據(jù)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)（LAMP)的原 理，針對靶基因的特定區(qū)域設(shè)計4條特異性引物，利用具有鏈置換特性的DNA聚合酶和AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶使RT和LAMP反應(yīng)在同管中同時進行，簡化了操作步驟，在等溫條件下就可以高 效、高特異地擴增靶序列。LAMP產(chǎn)物的檢測一般采用瓊脂糖凝膠電泳、濁度觀察、熒光染料 觀察等方法。橫向側(cè)流（Latteral flow detect，LFD)試紙條是一種檢測產(chǎn)物的新方法，利 用反應(yīng)體系中的FITC標記的探針與生物素標記的LAMP擴增產(chǎn)物特異性雜交，減少了電泳 環(huán)節(jié)、染料顏色的人為目測差異以及由非特異性擴增造成的假陽性問題。
[0005] 盡管單獨來說上述兩種技術(shù)近年來得到了初步應(yīng)用，但是針對具體的病毒檢測的 適用條件尚需要廣泛深入的探索，目前本領(lǐng)域尚未有在基因II型草魚呼腸孤病毒檢測上 使用上述技術(shù)的先例。早期國內(nèi)曾研宄了基因III型的草魚呼腸孤病毒RT-LAMP檢測試劑 盒CN201210186709. 6, 一方面基因III型臨床很少見，這種檢測試劑盒并無市場需求；另一 方面，該方案的引物無法用于擴增其它的草魚呼腸孤病毒，將上述所公開的引物擴增基因 II型草魚呼腸孤病毒特異性太差，無法用于LFD試紙條檢測。本領(lǐng)域也曾有嘗試研宄艾滋 病病毒的RT-LAMP-LFD檢測方法，但是由于艾滋病病毒與基因II型草魚呼腸孤病毒存在巨 大的序列差異，其所用的探針對其他檢測無任何參考價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種針對基因II型草魚呼腸孤病毒的檢測方法，通 過所使用的兩對引物和特異性探針，高效、高靈敏度的實現(xiàn)基因II型草魚呼腸孤病毒的檢 測。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種基因II型草魚呼腸孤病毒的檢測試劑盒，該試 劑盒內(nèi)置了實現(xiàn)基因II型草魚呼腸孤病毒的RT-LAMP-LFD檢測所用的預(yù)混反應(yīng)液，在使用 時加入基因II型草魚呼腸孤病毒的RNA樣品即可實現(xiàn)快速、準確檢測。
[0008] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0009] 基因II型草魚呼腸孤病毒的檢測方法，包括下述步驟：1)提取草魚樣品的RNA，加 入到預(yù)混反應(yīng)液中；利用兩對引物對基因II型草魚呼腸孤病毒的保守區(qū)序列進行環(huán)介導(dǎo) 等溫核酸擴增，其中所用的引物分別為引物GCRVII-F3序列SEQ ID No :1、引物GCRVII-B3 序列 SEQ ID No:2;引物 GCRVII-FIP 序列 SEQ ID No:3、引物 GCRVII-BIP 序列 SEQ ID No: 4 ;并標記FITC探針，探針GCRVII-FITC-Probe序列SEQ ID No :5 ;2)將擴增產(chǎn)物滴加到 LFD試紙的點樣位置上，然后在點樣處前端滴緩沖液，待緩沖液移動到試紙的另一端至反應(yīng) 結(jié)束，根據(jù)試紙條上的顯色帶判定檢測結(jié)果。
[0010] 本發(fā)明所公開的檢測方法，采用的引物組是根據(jù)基因II型6CRV第六基因片段設(shè) 計的，能與RNA的特異性探針相結(jié)合，特異性和靈敏度高，其靈敏度高于RT-PCR的1000倍 以上；同時，結(jié)合所采用的LFD檢測技術(shù)，節(jié)省時間且儀器設(shè)備要求低，能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測， 1小時內(nèi)即可獲得檢測結(jié)果。
[0011] 在本發(fā)明中，步驟1)中擴增反應(yīng)所用的恒溫擴增預(yù)混反應(yīng)液由以下組份組成： 0? 15-0. 25 y M GCRVII-F3 和 GCRVII-B3,1-2 y M GCRVII-FIP 和 GCRVII-BIP，0? 03-0. 08 y M GCRVII-FITC-Probe，15-25mM pH 8. 0 ~9. 0Tris-HCl，8-15mM 氯化鉀，10-20mM 硫酸銨， 5-12mM 硫酸鎂，0? 1-0.2% Triton X-100,0.4-0. 8M 甜菜堿，l-2mM dNTP，0.8-1. 5U 逆轉(zhuǎn)錄 酶AMV和6-10U Bst DNA聚合酶大片段，預(yù)混液體積為18-25 y L。
[0012] 對應(yīng)上述預(yù)混反應(yīng)液，所用的待測待檢樣品RNA的用量為3-6yL。
[0013] 優(yōu)選的，步驟1)中用于擴增反應(yīng)的恒溫擴增預(yù)混反應(yīng)液由以下組份組 成：0.2yM GCRVII-F3 和 GCRVII-B3，1.6yM GCRVII-FIP 和 GCRVII-BIP，0.05yM GCRVII-FITC-Probe，20mM pH8. 0 ~9. OTris-HCl，10mM 氯化鉀，15mM 硫酸銨，8mM 硫酸鎂， 0. l%Triton X-100,0.6M 甜菜堿，1.4mM dNTP，lU 逆轉(zhuǎn)錄酶 AMV 和 8U Bst DNA 聚合酶大片 段，預(yù)混液體積為21 y L。
[0014] 優(yōu)選的，對應(yīng)預(yù)混反應(yīng)液的待測待檢樣品RNA的用量為4 y L。
[0015] 對于恒溫擴增的反應(yīng)條件，采用本領(lǐng)域通用的反應(yīng)條件，即在64°C，反應(yīng)30~ 60min〇
[0016] 在本發(fā)明中，步驟2)擴增產(chǎn)物用量為5~10 y L，LFD試紙緩沖液的用量為50~ 100 y L，5~10分鐘后根據(jù)LFD試紙條上的顯色帶判定檢測結(jié)果。
[0017] 其中判斷檢測結(jié)果的標準為當僅出現(xiàn)質(zhì)控帶時表明反應(yīng)結(jié)果為陰性，當質(zhì)控帶和 檢測帶同時出現(xiàn)時，表明反應(yīng)結(jié)果為陽性。
[0018] 在本發(fā)明中，并未公開所用的緩沖液特定類型，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，LFD試紙 及其匹配的緩沖液是廠家一起出售的，根據(jù)商品操作說明的指導(dǎo)使用即可，通常這種緩沖 液是lxTAE緩沖液。
[0019] 在本發(fā)明中，并不對RNA的提取進行特別限定，本領(lǐng)域常見的草魚RNA提取方法均 可用于本發(fā)明，本領(lǐng)域已經(jīng)公開的類似檢測方法中的提取RNA操作亦可用于本發(fā)明。
[0020] 為了便于大規(guī)模、工業(yè)化、快速操作上述檢測方法，本發(fā)明還公開了基于上述方法 實現(xiàn)的基因II型草魚呼腸孤病毒的檢測試劑盒，其核心在于包含有上述的恒溫擴增預(yù)混 反應(yīng)液，由以下組份組成：〇? 15-0. 25 y M GCRVII-F3 和 GCRVII-B3,1-2 y M GCRVII-FIP 和 GCRVII_BIP，0. 03-0. 08 yM GCRVII-FITC-Probe，15-25mM pH 8. 0 ~9. 0Tris-HCl，8-15mM 氯化鉀，10-20mM硫酸銨，5-12mM硫酸鎂，0? 1-0. 2% Triton X-100,0. 4-0. 8M甜菜堿，l-2mM dNTP，0. 8-1. 5U逆轉(zhuǎn)錄酶AMV和6-10U Bst DNA聚合酶大片段，預(yù)混液體積為18-25 y L。。
[0021] 優(yōu)選的，恒溫擴增預(yù)混反應(yīng)液由以下組份組成：0. 2yM GCRVII-F3和GCRVII-B3， 1.6yM GCRVII-FIP 和 GCRVII-BIP，0.05yM GCRVII-FITC-Probe，20mM pH8.0 ~ 9.0Tris-HCl，10mM 氯化鉀，15mM 硫酸銨，8mM 硫酸鎂，0? 1% Triton X-100,0.6M 甜菜堿， 1. 4mM dNTP，1U逆轉(zhuǎn)錄酶AMV和8U Bst DNA聚合酶大片段，預(yù)混液體積為21 y L。
[0022] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，基于上述所含有的恒溫擴增預(yù)混反應(yīng)液結(jié)合其它常見 的RNA提取試劑盒結(jié)合即可實現(xiàn)檢測目的。為了提高操作的集成度，簡便操作，所述檢測 試劑盒還包括樣品裂解液、去蛋白液、漂洗液和70%無水乙醇、RNase free water、核酸吸 附柱，其中樣品裂解液組成為40-60mM pH7. 4Tris-HCL，3-5M的異硫氰酸胍，8-15mM EDTA ; 去蛋白液組成為20-40禮？117.4的1'1^8-1〇^0.3-0.511異硫氰酸胍和15-25%無水乙醇； 漂洗液組成為20-40mM pH7. 4的Tris-HCL，100-150mM NaCl和75%的無水乙醇；優(yōu)選的， 樣品裂解液組成為50mM pH7. 4Tris-HCL，4M的異硫氰酸胍，10mM EDTA ;去蛋白液組成為 30禮口117.4的1^8-1〇^0.411異硫氰酸胍和20%無水乙醇；漂洗液組成為301111口117.4的 Tris-HCL，130mM NaCl 和 75%的無水乙醇。
[0023] 進一步的，檢測試劑盒還包括陰性對照品、陽性對照品、LFD檢測試紙條、LFD檢測 試紙條緩沖液。
[0024] 其中，LFD試紙用的緩沖液一般為lxTAE緩沖液，陽性對照樣品為基因II型草魚 呼腸孤病毒RNA，陰性對照樣品為無核酸的RNase free water。
[0025] 本發(fā)明所公開的基因II型草魚呼腸孤病毒的檢測方法以及試劑盒，是基于基因 II型GCRV基因的保守區(qū)序列設(shè)計的兩對引物和特異性探針，從而建立GCRVRT-LAMP反應(yīng) 體系，并結(jié)合橫向側(cè)流試紙條來檢測基因II型草魚呼腸孤病毒，其具有特異性強，敏感性 高，操作簡便快捷的特點，可用于草魚養(yǎng)殖過程中基因II型GCRV的跟蹤監(jiān)測和早期診斷， 避免病毒傳播流行，提高科學(xué)管理效率。所公開的試劑盒可以使處于生產(chǎn)一線的技術(shù)員和 養(yǎng)殖戶方便快捷的實現(xiàn)對應(yīng)病毒的檢測，按照簡單的使用步驟說明即可操作，并且試劑盒 所用的各種試劑不含氯仿、巰基乙醇等有害物質(zhì)，對人和環(huán)境較安全。
【附圖說明】
[0026] 圖1為擴增溫度對RT-LAMP反應(yīng)的影響圖。M : 1DL2000DNA Marker (TaKaRa公司）； 泳道 1 :61°C ;泳道 2 :62°C ;泳道 3 :63°C ;泳道 4 :64°C ;泳道 5 :65°C。
[0027] 圖 2 為基因 II 型 GCRV RT-LAMP 特異性實驗結(jié)果圖。M :DL2000D