使用非干擾性噪音消除性多核苷酸鑒定標(biāo)簽的多重焦磷酸測序的制作方法
【專利說明】使用非干擾性噪音消除性多核苷酸鑒定標(biāo)簽的多重焦磷酸 測序
[0001] 相關(guān)f獻(xiàn)的奪叉引用
[0002] 本申請要求2012年9月24日提交的，標(biāo)題為"使用非干擾性噪音消除性多核苷酸 鑒定標(biāo)簽的多重焦磷酸測序"的美國臨時申請?zhí)?1/705, 089的優(yōu)先權(quán)，其通過引用并入本 文。
[0003] 序列表
[0004] 本申請含有序列表，其以ASCII格式通過EFS-Web提交并且在此以其整體通過參 考并入。2013年9月23日建立的所述ASCII拷貝命名為15892-0002_SL.txt并且大小為 I 5, 781 字節(jié)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明涉及分析和測序核酸樣品的方法學(xué)。更具體地，本發(fā)明涉及通過使用特異 性多核苷酸鑒定標(biāo)簽測序擴(kuò)增的核酸樣品的方法。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 核酸擴(kuò)增方法學(xué)的發(fā)展，例如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)，使得DNA擴(kuò)增用于多種用途， 包括分子診斷試驗(yàn)。然而，存在與PCR用于分子差別診斷（MDD)測定相關(guān)的挑戰(zhàn)。PCR使用 特異性引物或引物組、溫度條件、和酶。例如，PCR反應(yīng)容易被污染，引物結(jié)合對于不同引物 可能需要不同條件并且引物應(yīng)該特異性于靶序列從而僅擴(kuò)增該靶序列。這些限制使得更加 難以從單一樣品擴(kuò)增多個序列。
[0008] 過去，用于發(fā)現(xiàn)一種或多種致病病原體的臨床樣品診斷試驗(yàn)需要該微生物被分離 或培養(yǎng)。然而，這可能耗費(fèi)數(shù)天，并且在很多情況中，如果要挽救患者的生命診斷，必須在幾 小時內(nèi)進(jìn)行。分析單個臨床樣品以鑒定多種微生物從而確定哪個（那些）可能是疾病的病 原體，是MDD所需方法，并且已經(jīng)開發(fā)出方法以更好地實(shí)現(xiàn)該目的。例如，已經(jīng)開發(fā)了多重 PCR方法來擴(kuò)增樣品內(nèi)的多種核酸，從而產(chǎn)生足夠的DNA/RNA，使得能夠檢測和鑒定多種微 生物。然而，多重PCR具有缺點(diǎn)。例如，多重PCR反應(yīng)中的各個靶需要其自身的最佳反應(yīng)條 件，因此增加靶數(shù)量需要用于各個個體靶的反應(yīng)條件是欠佳的。此外，系統(tǒng)中多組高濃度引 物常常產(chǎn)生引物二聚體或產(chǎn)生非特異性、背景擴(kuò)增。這種特異性的缺陷還需要PCR后清理 和多次雜交后洗滌的額外步驟。
[0009] 由于需要可用的酶和消耗底物，聚集的引物降低擴(kuò)增效率。擴(kuò)增效率的差異可以 導(dǎo)致擴(kuò)增子產(chǎn)量的顯著差異。例如，一些位點(diǎn)可以非常高效地?cái)U(kuò)增，而其它的非常無效率地 擴(kuò)增或根本不能擴(kuò)增。該不均勻擴(kuò)增的可能還使得難以精確進(jìn)行進(jìn)行終點(diǎn)定量分析直到不 可能精確進(jìn)行進(jìn)行終點(diǎn)定量分析。
[0010] 經(jīng)常，時間是至關(guān)重要的，患者感染包括多于一種細(xì)菌物種，并且臨床樣品中靶 DNA的量是有限的。已經(jīng)開發(fā)了技術(shù)比如多重PCR以解決該問題。然而，仍然需要該領(lǐng)域中 的改善，從而進(jìn)一步減少完成快速和精確臨床樣品分析所需的時間和努力?？梢宰詣拥模?別是通過使用用于樣品制備和分析的封閉盒的方法，是特別重要的，因?yàn)樗鼈兛梢蕴峁└?加的優(yōu)勢：減少樣品的可能污染和減少實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員在制備和分析各樣品方面必須花費(fèi) 的時間和努力。
[0011] 盡管在多重測序技術(shù)和它們在樣品分析方面已經(jīng)有顯著的進(jìn)步，如果這些能夠被 進(jìn)一步改善以使分析和檢測更容易，將會是高度有益的。
[0012] 發(fā)明概沭
[0013] 本發(fā)明涉及用于分析可以包含混合DNA或RNA群體的樣品的多重方法，所述方法 包括使用多核苷酸擴(kuò)增以產(chǎn)生其中一種或多種靶序列用非干擾性、非消除性靶特異性多核 苷酸鑒定標(biāo)簽標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，和通過非干擾性、非消除性靶特異性多核苷酸鑒定標(biāo)簽序 列焦磷酸測序所述擴(kuò)增的產(chǎn)物來檢測一種或多種特異性多核苷酸鑒定標(biāo)簽的存在，特異性 多核苷酸鑒定標(biāo)簽的存在與特異性靶序列的存在相關(guān)聯(lián)。在一個實(shí)施方案中，所述多核苷 酸可以包括DNA，RNA或混合的DNA/RNA群體。在另外的實(shí)施方案中，所述多重反應(yīng)包括PCR 反應(yīng)。
[0014] 本發(fā)明的方面還涉及用于分析含有一種或多種未鑒定多核苷酸的樣品的多重方 法，所述方法包括以下步驟：將靶特異性引物連接于靶獨(dú)特的非干擾性、非消除性多核苷酸 鑒定標(biāo)簽，將所述靶特異性引物雜交于靶多核苷酸序列，進(jìn)行多核苷酸擴(kuò)增來擴(kuò)增所述靶 多核苷酸序列并且將靶獨(dú)特的非干擾性、非消除性多核苷酸鑒定標(biāo)簽添加于所述靶多核苷 酸序列，并且焦磷酸測序所述靶獨(dú)特的非干擾性、非消除性靶特異性多核苷酸鑒定標(biāo)簽，其 中鑒定出靶獨(dú)特的非干擾性、非消除性靶特異性多核苷酸鑒定標(biāo)簽，表明靶多核苷酸的存 在。在一個實(shí)施方案中，所述多核苷酸可以包括DNA，RNA或混合的DNA/RNA群體。此外，所 述多重反應(yīng)包括PCR反應(yīng)。
[0015] 本發(fā)明的方面還涉及多重PCR焦磷酸測序方法，其中所述靶獨(dú)特的非干擾性、非 消除性多核苷酸鑒定標(biāo)簽選自由以下各項(xiàng)組成的序列組：SEQ ID N0 :1，SEQ ID N0 :2, SEQ ID NO ：3, SEQ ID NO ：4, SEQ ID NO ：5, SEQ ID NO ：6, SEQ ID NO ：7, SEQ ID NO ：8, SEQ ID N0：9,SEQ ID NO： 10, SEQ ID NO： 11, SEQ ID NO： 12, SEQ ID NO： 13, SEQ ID NO： 14, SEQ ID NO ：15, SEQ ID NO ：16, SEQ ID NO ：17, SEQ ID NO ：18, SEQ ID NO ：19, SEQ ID NO ：20, SEQ ID NO ：21, SEQ ID NO ：22, SEQ ID NO ：23, SEQ ID NO ：24, SEQ ID NO ：25, SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：27, SEQ ID NO ：28, SEQ ID NO ：29, SEQ ID NO ：30, SEQ ID NO ：31, SEQ ID NO ： 32, SEQ ID NO ：33, SEQ ID NO ：34, SEQ ID NO ：35, SEQ ID NO ：36, SEQ ID NO ：37, SEQ ID NO ：38, SEQ ID NO ：39, SEQ ID NO ：40, SEQ ID NO ：41, SEQ ID NO ：42, SEQ ID NO ：43, SEQ ID NO ：44, SEQ ID NO ：45, SEQ ID NO ：46, SEQ ID NO ：47, SEQ ID NO ：48, SEQ ID NO ：49, SEQ ID NO ：50, SEQ ID NO ：51, SEQ ID NO ：52, SEQ ID NO ：53, SEQ ID NO ：54, SEQ ID NO ： 55, SEQ ID NO :56, SEQ ID NO :57, SEQ ID NO :58, SEQ ID NO :59,和 SEQ ID NO :60。
[0016]本發(fā)明的一個方面使用嵌套靶特異性引物。靶核酸可以包含DNA和/或RNA，并 且可以包括病毒、細(xì)菌和/或真菌來源的DNA和/或RNA，以及人或其它動物來源的基因組 DNA和/或RNA。擴(kuò)增可以通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)和/或RT-PCR進(jìn)行。靶核酸的來源可 以源自一種或多種臨床、環(huán)境、或食物樣品并且所述方法可以以多種方式使用，包括，例如， 臨床診斷、環(huán)境取樣、植物測試、食品安全分析、遺傳疾病檢測、和/或疾病病狀檢測。所述 方法可以用于人和/或獸醫(yī)學(xué)診斷。
[0017]附圖簡沭
[0018]圖1是用于使用PCR連接靶特異性或靶獨(dú)特性多核苷酸鑒定標(biāo)簽的方法的實(shí)例的 說明。在圖1中，"索引標(biāo)簽"表示靶特異性（靶獨(dú)特性）多核苷酸鑒定標(biāo)簽。Fo, Fi，F(xiàn)c， Ro, Ri，和Rc表明引物序列和位置。
[0019]詳細(xì)說明
[0020] 焦磷酸測序是基于核酸合成過程中釋放的焦磷酸鹽的檢測的核酸測序技術(shù)。在該 酶促反應(yīng)過程中產(chǎn)生可見光，如果整合入核苷酸，其與數(shù)量呈比例。作為由酶聚合酶導(dǎo)致的 核苷酸并入的結(jié)果無機(jī)焦磷酸鹽被釋放。在一些實(shí)施方案中，使用熒光素酶產(chǎn)生光，所述光 容易通過光電二極管，光電倍增管，或電荷稱合設(shè)備（CCD)相機(jī)檢測。由于添加的核苷酸已 知，因此模板核酸的可以序列被確定。用DNA和RNA二者焦磷酸測序都是可能的?；旧?， 所述方法允許通過一次一個堿基合成其互補(bǔ)鏈測序單鏈單鏈核酸，和通過測量核苷酸整合 過程中發(fā)出的光檢測每一步哪個堿基被添加。焦磷酸測序代表用于來自細(xì)菌、病毒、真菌和 其它類似來源的核酸應(yīng)用以從臨床樣品輔助鑒定的快速、精確方法。然而，焦磷酸測序是平 行-測序方法-一般需要多種平行測序運(yùn)行來分析混合樣品。在單個容器中進(jìn)行該測序方 法（如用多重PCR測序方法），能夠顯著降低產(chǎn)生所需結(jié)果所需的成本和時間。本發(fā)明人已 經(jīng)開發(fā)了方法，所述方法將允許焦磷酸測序以真正的多重方式進(jìn)行-在單一多重反應(yīng)中測 序和檢測多個樣品，而不是多個平行反應(yīng)。
[0021]本發(fā)明人認(rèn)識到，焦磷酸測序的優(yōu)勢-測序結(jié)果的檢測是基于在DNA合成過程中 添加的核苷酸產(chǎn)生的釋放的焦磷酸鹽發(fā)出的光的事實(shí)-總體上排除了多重PCR和測序的 使用，因?yàn)槎鄠€不同的序列的檢測變得相對不可能。然而，他們已經(jīng)開發(fā)出克服該障礙的 方法。這樣做時，他們已經(jīng)產(chǎn)生可以在單個盒的限制內(nèi)進(jìn)行的用于多重多核苷酸擴(kuò)增和焦 憐酸測序的方法，比如在 W0/2010/132834(Apparatus for Performing Amplicon Rescue Multiplex PCR(用于進(jìn)行擴(kuò)增拯救多重PCR的裝置））中描述的方法中使用的那種盒，其在 本文以其整體通過引用并入。
[0022] 要理解，術(shù)語"包含（comprising) "，如本文使用的，可以用術(shù)語"基本上由….構(gòu) 成"和"由...構(gòu)成"替代。使用術(shù)語"反應(yīng)體系"處，意在描述Eppendorf管，反應(yīng)室，或其 它容器裝置，其中放置必要引物、酶、核苷酸、緩沖液和/或其它試劑，從而進(jìn)行一個或多個 循環(huán)的至少一種聚合酶鏈反應(yīng)。不同"反應(yīng)體系"可以因此指相同反應(yīng)容器，但用于進(jìn)行所 需擴(kuò)增步驟的不同試劑組分-特別是引物。"反應(yīng)容器"意在指管、板孔、或其它具有充足內(nèi) 部容積以含有引物、酶、核苷酸、緩沖劑和/或提供反應(yīng)體系所需的其它試劑的容器。術(shù)語 "拯救"意在指從第一次擴(kuò)增的至少部分引物中分離擴(kuò)增子。"PCR"意在指聚合酶鏈反應(yīng)， 并且可以包括PCR和/或RT-PCR過程。
[0023]在一個實(shí)施方案中，本文描述的方法包括使用多核苷酸擴(kuò)增來產(chǎn)生擴(kuò)增的產(chǎn)物， 其中一種或多種靶序列用非干擾性、非消除性靶特異性多核苷酸鑒定標(biāo)簽標(biāo)記。"非干擾 性、非消除性靶特異性多核苷酸鑒定標(biāo)簽"，如本文定義的，指當(dāng)結(jié)合靶序列或引物時，不干 擾聚合酶的功能，不改變位于核苷酸模板或引物的末端的核苷酸結(jié)構(gòu)，不干擾引物對模板 的退火，不在靶多核苷酸中引入復(fù)合體結(jié)構(gòu)，或另外不干擾或阻止引物的結(jié)合和/或靶核 苷酸的擴(kuò)增的多核苷酸序列。本發(fā)明描述的方法可以使用DNA樣品，RNA靶，或混合DNA/ RNA群體的靶標(biāo)。在另外的實(shí)施方案中，公開的方法可以使用PCR和/或逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反 應(yīng)（RT-PCR)用于擴(kuò)增多核苷酸。
[0024] 在一個實(shí)施方案中，包括用鑒定標(biāo)簽標(biāo)記的靶序列的產(chǎn)物的擴(kuò)增可以使用如在 W0/2009/124293中描述的擴(kuò)增子拯救多重聚合酶鏈反應(yīng)，和使用W0/2010/132834中描述 的方法和裝置來完成，其內(nèi)容以其整體通過引用并入本文。簡言之，使用高濃度、靶特異性 嵌套引物進(jìn)行靶特異性第一擴(kuò)增步驟。例如靶特異性引物可以用于擴(kuò)增一種或多種（并且 優(yōu)選多種）細(xì)菌、病毒、真菌和/或其它來源的靶核酸。靶核酸可以是人或動物來源。在 一個實(shí)施方案中，所述靶核酸來源于人臨床樣品。如在圖1中說明的，正向引物匕連接于 另外的核苷酸或用另外的核苷酸"標(biāo)記"以提供不特異性于靶核酸的另外的序列，從而用此 中引物擴(kuò)增靶核酸B還將把圖1中作為"索引序列"的非干擾性、非消除性靶特異性多核苷 酸鑒定標(biāo)簽整合入產(chǎn)生的擴(kuò)增子。在一個實(shí)施方案中，所述非干擾性、非消除性靶特異性 多核苷酸鑒定標(biāo)簽選自表1中列出的那些。所述方法整合另外的引物FC和F。，其功能在 W0/2009/124293中詳細(xì)描述。擴(kuò)增進(jìn)行，反應(yīng)終止，并