用于量化樣品中核酸序列的組合物和方法
【專利說明】用于量化樣品中核酸序列的組合物和方法
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求2012年4月9日提交的美國臨時申請?zhí)?1/621，975的權(quán)益，所述申請通過引用以其全文結(jié)合在此。
[0003]發(fā)明背景
[0004]核酸擴增技術(shù)已經(jīng)提供了理解復(fù)雜生物學過程，檢測、鑒定、和量化病原性和非病原性有機體，法醫(yī)犯罪學分析，疾病相關(guān)研宄，以及遺傳上修飾過的有機體中的事件的檢測等的手段。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)是用于擴增DNA的常用熱循環(huán)依賴性核酸擴增技術(shù)，所述技術(shù)由多個循環(huán)的、用于DNA熔化和使用DNA聚合酶的DNA的酶復(fù)制的反應(yīng)的重復(fù)加熱和冷卻組成。實時定量PCR(qPCR)是用于量化生物樣品中給定核酸序列的拷貝數(shù)的技術(shù)。目前，qPCR利用了貫穿所述反應(yīng)的實時反應(yīng)產(chǎn)物檢測，并且比較擴增圖譜與在每個反應(yīng)開始時包含已知量的核酸(或核酸與未知的所測試的核酸的已知相對比率)的對照的擴增。對照的結(jié)果用于構(gòu)建標準曲線，典型地基于標準反應(yīng)擴增曲線的對數(shù)部分。基于與標準對照量進行比較的它們的擴增曲線的情況，這些值用于插入未知物的量。
[0005]除了 PCR，現(xiàn)存的非熱循環(huán)依賴性擴增系統(tǒng)或等溫核酸擴增技術(shù)包括但不局限于:切口和延伸擴增反應(yīng)(NEAR)、滾環(huán)擴增(RCA)、解旋酶依賴性擴增(HDA)、環(huán)介導(dǎo)擴增(LAMP)、鏈置換擴增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增(TMA)、自動維持序列擴增(3SR)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、單引物等溫擴增(SPIA)、Q-f3復(fù)制酶系統(tǒng)、以及重組酶聚合酶擴增(RPA)。
[0006]NEAR擴增具有與PRC熱循環(huán)的相似性。類似于PRC，NEAR擴增采用與PCR中稱為引物并且在NEAR中稱為模板的靶序列互補的寡核苷酸序列。此外，靶序列的NEAR擴增導(dǎo)致靶序列的對數(shù)增長，就像它在標準PCR中的表現(xiàn)一樣。不像PCR，NEAR反應(yīng)是等溫地進展。在標準PCR中，溫度是增加的，用來允許兩個DNA鏈分開。在NEAR反應(yīng)中，靶核酸序列在測試樣品中存在的特異性切口位點處是切口的。聚合酶滲入切口位點并且與現(xiàn)存互補DNA鏈的置換一起開始切口的靶核苷酸序列(添加的外源DNA)的互補鏈合成。鏈置換復(fù)制過程排除了對增加的溫度的需求。此時，模板/引物分子從添加的外源DNA退火成置換的互補序列。聚合酶現(xiàn)在從模板的3’端延伸，產(chǎn)生先前置換的鏈的互補鏈。然后第二模板/引物寡核苷酸退火成新合成的互補鏈并且延伸，制成包括切口酶識別序列的NDA的雙鏈體。所述鏈然后傾向于被切口，伴隨通過聚合酶的隨后的鏈置換延伸，這導(dǎo)致在原有革E DNA的任一側(cè)上具有切口位點的DNA的雙鏈體的產(chǎn)生。一旦這被合成，繼續(xù)通過置換的鏈與新模板分子一起的復(fù)制指數(shù)地擴增所述分子。此外，還通過在模板引入的切口位點的切口翻譯合成的重復(fù)動作，擴增從每個產(chǎn)物分子線性地繼續(xù)進行。結(jié)果是靶信號擴增的非常迅速的增長；與PCR熱循環(huán)相比，遠遠更快，其中擴增導(dǎo)致小于十分鐘。
[0007]然而，量化已經(jīng)成了問題。實時NEAR系統(tǒng)的最佳性能取決于特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生和擴增。已知除了通過反應(yīng)酶的特異性產(chǎn)物，NEAR系統(tǒng)產(chǎn)生顯著水平的非特異性背景產(chǎn)物。這些背景產(chǎn)物可以用作可擴增實體，并且它們的產(chǎn)生會勝過特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。雖然可能設(shè)計特異性針對希望的靶的檢測探針(并且因此在復(fù)雜背景中，特異性產(chǎn)物是可檢測的)，但是顯著水平的非特異性背景產(chǎn)物隔離了可能已經(jīng)另外用于特異性產(chǎn)物的擴增的反應(yīng)組分。因此，由于非特異性背景產(chǎn)物產(chǎn)生引起的反應(yīng)組分隔離導(dǎo)致次優(yōu)的反應(yīng)。當靶核酸最初處于非常低的豐度時，并且在靶的可靠檢測需要高度優(yōu)化的反應(yīng)的情況下，這是特別麻煩的。而且，次優(yōu)的反應(yīng)不會表示靶核酸的真實量化，即使它是可檢測的。會有利的是，產(chǎn)生消除非特異性背景產(chǎn)物的擴增的優(yōu)化的NEAR反應(yīng)。這樣做會通過基于標準曲線的系統(tǒng)抑或相對量化，提供適合量化的反應(yīng)。
[0008]而且，通常的做法是使用質(zhì)譜法來評價NEAR反應(yīng)。高水平的背景產(chǎn)物會模糊質(zhì)譜法數(shù)據(jù)的判讀。例如，如果反應(yīng)包含背景產(chǎn)物、源自非特異性擴增(來自仍相關(guān)的不相似的靶)的一種或更多種產(chǎn)物、以及特異性產(chǎn)物，則從背景產(chǎn)物鑒定這些基質(zhì)衍生的產(chǎn)物將是挑戰(zhàn)性的。背景產(chǎn)物的消除導(dǎo)致具體測定的性能/特異性的清晰確定。
[0009]額外地，高水平的背景產(chǎn)物會阻礙有意的雙重或多重反應(yīng)的最佳擴增。雖然多重的、差異化標記的檢測探針是與實時檢測相容的，但是由于非特異性產(chǎn)物形成，仍存在反應(yīng)物限制的問題。對于雙重或多重反應(yīng)而言，這是特別真實的，其中這些反應(yīng)包含可以潛在地形成背景產(chǎn)物的復(fù)雜群體的多于兩種的模板/引物。消除了背景產(chǎn)物的擴增的NEAR反應(yīng)系統(tǒng)還提供了用于實時檢測有意的雙重或多重反應(yīng)的條件。會高度有利的是，提供了用來消除可擴增背景產(chǎn)物的手段，因此使NEAR反應(yīng)中產(chǎn)生特異性產(chǎn)物的潛能最大化。會希望的是，是否可以通過反應(yīng)進展的實時準確監(jiān)測，提供定量結(jié)果。
[0010]發(fā)明概述
[0011]如以下描述，本發(fā)明特征在于用于實時檢測樣品中的靶寡核苷酸的組合物和方法，所述方法減少或消除了背景產(chǎn)物的產(chǎn)生，以允許所述樣品靶寡核苷酸的量化。這些方法是與使用NEAR反應(yīng)擴增靶寡核苷酸相容的。本發(fā)明至少部分基于以下發(fā)現(xiàn):在單重NEAR反應(yīng)中可以產(chǎn)生特異性產(chǎn)物，而不產(chǎn)生背景產(chǎn)物。這些反應(yīng)組合物和方法提供了未知測試樣品、雙重反應(yīng)、以及多重反應(yīng)的相對量化，以及用于未知測試樣品的絕對量化的標準曲線的產(chǎn)生。
[0012]在一個方面，本發(fā)明提供了量化切口和延伸擴增反應(yīng)中特異性產(chǎn)物的方法，所述方法涉及:在基本上等溫條件下，使靶核酸分子與以下接觸:外切酶缺陷的聚合酶、兩種或更多種引物/模板寡核苷酸(其中每一個特異性結(jié)合所述靶核酸分子上的互補序列)、切口酶、以及可檢測的多核苷酸探針，其中每個引物/模板寡核苷酸在與所述靶核酸分子互補的序列中具有一個或更多個2’修飾的核苷酸；產(chǎn)生具有至少一部分所述靶核酸分子的多個擴增子；并且檢測特異性針對與所述靶核酸分子或其擴增子雜交的寡核苷酸探針的信號，其中所述信號表明在所述樣品中存在的靶核酸分子或其擴增子的量。
[0013]在另一個方面，本發(fā)明提供了用于檢測在單個反應(yīng)的過程中產(chǎn)生的多種不同反應(yīng)產(chǎn)物的方法，所述方法涉及:在基本上等溫條件下，使靶核酸分子與以下接觸:外切酶缺陷的聚合酶、兩種或更多種引物/模板寡核苷酸(其中每一個特異性結(jié)合所述靶核酸分子上的互補序列)、切口酶、以及可檢測的多核苷酸探針，其中每個引物/模板寡核苷酸在與所述靶核酸分子互補的序列中具有一個或更多個2’修飾的核苷酸；產(chǎn)生具有至少一部分所述靶核酸分子的多個擴增子；并且檢測特異性針對與所述靶核酸分子或其擴增子雜交的寡核苷酸探針的信號，其中所述信號表明在所述樣品中存在的靶核酸分子或其擴增子的量。
[0014]在一個具體方面，本發(fā)明提供了量化切口和延伸擴增反應(yīng)中特異性產(chǎn)物的方法，所述方法涉及:在基本上等溫條件下，使靶核酸分子與以下接觸:外切酶缺陷的聚合酶、兩種引物/模板寡核苷酸(其中每一個特異性結(jié)合所述靶核酸分子上的互補序列)、切口酶、以及可檢測的多核苷酸探針，其中每個引物/模板寡核苷酸具有定位在與所述靶核酸分子互補的序列的3’端(例如所述寡核苷酸的3’末端)或其附近的至少約5個連續(xù)的2’-0_甲基修飾的核苷酸；產(chǎn)生具有至少一部分所述靶核酸分子的多個擴增子；并且檢測特異性針對與所述靶核酸分子或其擴增子雜交的寡核苷酸探針的信號，其中所述信號表明在所述樣品中存在的靶核酸分子或其擴增子的量。
[0015]在一個方面，本發(fā)明提供了用于實時監(jiān)測切口和延伸擴增反應(yīng)的方法，所述方法涉及:在基本上等溫條件下，使測試樣品與以下接觸:外切酶缺陷的聚合酶、兩種或更多種引物/模板寡核苷酸(其中每一個特異性結(jié)合靶核酸分子上的互補序列)、切口酶、以及可檢測的多核苷酸探針，其中每個引物/模板寡核苷酸在與所述靶核酸分子互補的序列中具有一個或更多個2’修飾的核苷酸；產(chǎn)生具有至少一部分所述靶核酸分子的多個擴增子；并且實時檢測信號，由此量化所述一個或更多個靶核酸分子。
[0016]在另一個方面，本發(fā)明提供了用于實時監(jiān)測NEAR反應(yīng)中靶核酸分子的方法，所述方法涉及:在基本上等溫條件下，使靶核酸分子與以下接觸:外切酶缺陷的聚合酶、兩種或更多種引物/模板寡核苷酸(其中每一個特異性結(jié)合所述靶核酸分子上的互補序列)、切口酶、異源雙鏈特異性的切口酶、以及可檢測的多核苷酸探針，其中每個引物/模板寡核苷酸在與所述靶核酸分子互補的序列中具有一個或更多個2’修飾的核苷酸；產(chǎn)生具有結(jié)合所述可檢測寡核苷酸探針的靶序列的多個擴增子；并且實時檢測信號，由此量化所述靶核酸分子。
[0017]仍在另一個方面，本發(fā)明提供了用于實時監(jiān)測測試樣品中靶核酸分子的方法，所述方法涉及:在基本上等溫條件下，使靶核酸分子與以下接觸:聚合酶、兩種或更多種引物/模板寡核苷酸(其中每一個特異性結(jié)合所述靶核酸分子上的互補序列)、切口酶、修復(fù)酶或校正讀碼酶、以及可檢測的多核苷酸探針，其中每個引物/模板寡核苷酸在與所述靶核酸分子互補的序列中具有一個或更多個2’修飾的核苷酸；產(chǎn)生具有結(jié)合所述可檢測寡核苷酸探針的靶序列的多個擴增子；并且實時檢測信號，由此量化所述靶核酸分子。
[0018]仍在另一個方面，本發(fā)明提供了用于檢測NEAR反應(yīng)中的靶序列的試劑盒，所述試劑盒包含一個或更多個引物/模板寡核苷酸，以及用于本發(fā)明的方法中的引物/模板寡核苷酸的用途的說明書，這個或這些引物/模板寡核苷酸特異性結(jié)合靶核酸分子上的互補序列并且在與所述靶核酸分子互補的序列中具有一個或更多個2’修飾的核苷酸。
[0019]在一個方面，本發(fā)明提供給了從5’至3’，具有第一區(qū)和第二區(qū)的分離的寡核苷酸，其中所述第一區(qū)具有切口酶識別序列；其中所述第二區(qū)具有特異性結(jié)合靶核酸分子上的互補序列的至少9個或更多個核苷酸(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或更多個連續(xù)的核苷酸)；并且其中所述第二區(qū)具有一個或更多個2’修飾的核苷酸。在其他實施例中，所述分離的寡核苷酸是列出于圖1中的那個。
[0020]在本文描繪的多個方面的不同實施例中，寡核苷酸(例如引物/模板寡核苷酸、分離的寡核苷酸)包含修飾的核苷酸，包括2’修飾的核苷酸。在本文描繪的任何方面的不同實施例中，2’修飾是以下中的一個或更多個:2’ -O-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2 ' _氟代、2’-輕基、2'-稀丙基、2' -0-[2_ (甲基氨基)-2-氧代乙基]、4 '-疏基、4' -CH2-0-2'-橋、4' -(CH2)2-O^r -橋、2' _LNA、2’-烷基、以及'-0_(N-氨基甲酸甲酯)或修飾的核苷酸包含堿基類似物。在本文描繪的任何方面的不同實施例中，一個或更多個2’修飾的核苷酸定位在與靶核酸分子互補的序列的3’端(例如寡核苷酸的3’末端)或其附近。在本文描繪的任何方面的其他實施例中，一個或更多個2’修飾的核苷酸定位在與靶核酸分子互補的序列的5’端。在本文描繪的任何方面的不同實施例中，定位在與靶核酸分子互補的序列的5’端的一個或更多個2’修飾的核苷酸與切口位點隔開1、2、3、4、5或更多個未修飾的核苷酸。在本文描繪的任何方面的不同實施例中，兩個或更多個2’修飾的核苷酸是連續(xù)的(2、3、4、5、或更多個)。在本文描繪的任何方面的其他實施例中，兩個或更多個2’修飾的核苷酸是與未修飾的核苷酸交替的。在本文描繪的任何方面的不同實施例中，切口酶識別序列是5’ -GAGTC-3’。在本文描繪的任何方面的不同實施例中，5個連續(xù)的2’ -O-甲基修飾的核苷酸定位在與靶核酸分子互補的序列的3’端(例如寡核苷酸的3’末端)或其附近。在本文描繪的任何方面的其他實施例中，5個連續(xù)的2’ -O-甲基修飾的核苷酸定位在與靶核酸分子互補的序列的5’端。在本文描繪的任何方面的其他實施例中，與未修飾的核苷酸交替的2個或多個2’ -O-甲基修飾的核苷酸定位在與革El核酸分子互補的序列的5’端(即靶特異性區(qū)域)。
[0021]在本文描繪的任何方面的不同實施例中，檢測步驟并不檢測非靶分子的擴增子。在本文描繪的任何方面的不同實施例中，所述方法是實時進行的。在本文描繪的任何方面的某些實施例中，產(chǎn)生多個擴增子的步驟是實時進行的(例如用來確定存在于反應(yīng)中的靶的量)。
[0022]在本文描繪的任何方面的不同實施例中，所述方法提供了確定在擴增前，生物樣品中存在的核酸分子的量的半定量的和/或量閾值的方法。在本文描繪的任何方面的不同實施例中，將一個或更多個2’修飾的核苷酸定位為更接近在與靶核酸分子互補的序列的5’端增加了擴增的檢測時間。在本文描繪的任何方面的不同實施例中，所述方法進一步涉及使用引物/模板寡核苷酸的比率，來提供由不同量的起始靶材料引起的反應(yīng)產(chǎn)物的增加的分辨率。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，增加在識別序列的3’端具有一個或更多個2’修飾的核苷酸的引物/模板寡核苷酸與在識別序列的5’端具有一個或更多個2’修飾的核苷酸的引物/模板寡核苷酸的比率收縮了信號曲線并且移位了曲線的斜率。
[0023]在本文描繪的任何方面的不同實施例中，所述方法進一步涉及使用擴增速率改性劑，來提供由于不同量的起始靶材料引起的反應(yīng)產(chǎn)物的增加的分辨率。在本文描繪的任何方面的不同實施例中，革El核酸分子是DNA或RNA核酸分子。在本文描繪的任何方面的不同實施例中，可檢測探針是SY