p18小分子抑制劑及在人造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及P18小分子抑制劑及其在人臍帶血來(lái)源造血干細(xì) 胞的體外擴(kuò)增中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞因其具有自我更新及多向分化的能力而成為臨床上治療多種疾病的有效 途徑之一，這也代表了再生醫(yī)學(xué)新時(shí)代的到來(lái)。其中造血干細(xì)胞研宄開(kāi)始最早、研宄最為深 入且應(yīng)用最為廣泛。應(yīng)用骨髓移植治療白血病等惡性血液疾病已有50多年的歷史。但骨 髓中造血干細(xì)胞數(shù)量較低，移植后難以在病人體內(nèi)有效進(jìn)行造血重建，這也成為干細(xì)胞臨 床應(yīng)用的一個(gè)瓶頸。
[0003] 造血干細(xì)胞在體內(nèi)有多種選擇，例如自我更新、分化、迀移（歸巢）、靜息、凋亡等， 在這些不同的選擇背后，有一個(gè)非常復(fù)雜的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的不同命運(yùn)。例 如Wnt、Notch、Shh/BMP、TGF-0、IGF等發(fā)育相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白，Bmi等染色質(zhì)相關(guān)因子，HoxB、 NFk等轉(zhuǎn)錄因子，INK4、KIP、PTEN等細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白等均參與了該信號(hào)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。對(duì)于 造血干細(xì)胞而言，其最為重要的特性即為自我更新。目前已有多項(xiàng)研宄指出，造血干細(xì)胞的 自我更新調(diào)節(jié)與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)息息相關(guān)。進(jìn)入細(xì)胞周期是造血干細(xì)胞進(jìn)行自我更新的最 后一步，因此細(xì)胞周期，尤其是G1期的調(diào)節(jié)可能會(huì)對(duì)造血干細(xì)胞的自我更新產(chǎn)生至關(guān)重要 的作用。
[0004] 細(xì)胞周期主要通過(guò)連續(xù)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs)的活性變化來(lái)調(diào)控， 而⑶K的活性又必須取決于Cyclin的含量水平。在體內(nèi)，除了Cyclin和催化亞基的磷酸 化/去磷酸化的調(diào)控，CDK很大程度上還受CKIs(細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑）的調(diào)控。 目前已知CKI中兩類低分子量家族蛋白，Cip/Kip和INK4可以與⑶K反應(yīng)，并可抑制細(xì)胞 通過(guò)G1期。其中，Cip/Kip家族，主要包括p21，p27和p57,可以與很多Cyclin-CDK復(fù)合物 反應(yīng)；INK家族，主要包括pl6，pl5,pl8和pl9,可以特異性的抑制CDK4、6。
[0005] 越來(lái)越多的研宄表明，相對(duì)于其他的CKI而言，pl8對(duì)造血干細(xì)胞的自我更新調(diào)控 作用更為強(qiáng)大。例如，P18的缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠造血移植率的顯著升高，并且該種作用是通過(guò) 提高造血干細(xì)胞對(duì)稱性自我更新分裂的比率來(lái)實(shí)現(xiàn)的，相較于以往單純提高造血干細(xì)胞的 增殖效率，提高其對(duì)稱性分裂可免于導(dǎo)致造血干細(xì)胞的分化和耗竭。因此，P18是一個(gè)特異 影響造血干細(xì)胞自我更新的獨(dú)特的INK蛋白。
[0006] 目前體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞主要依靠向培養(yǎng)基中添加血清以及SCF、TPO、Flt3L等 細(xì)胞因子，但擴(kuò)增效果仍不理想，造血干細(xì)胞在體外很快便發(fā)生分化、衰竭。之前的研宄中 曾采用加入多種細(xì)胞因子液體培養(yǎng)基、與基質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)或在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)等方法 以體外擴(kuò)增造血干/祖細(xì)胞，但上述方法仍不能獲得充足的具有移植能力的造血干細(xì)胞來(lái) 進(jìn)行臨床治療。
[0007] 而小分子化合物則在體外培養(yǎng)中顯示了其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。首先，化合物的作用效果 可通過(guò)調(diào)節(jié)化合物的結(jié)構(gòu)、濃度來(lái)改變，其過(guò)程簡(jiǎn)單可控；其次，小分子化合物相較于細(xì)胞 因子或轉(zhuǎn)錄因子等其性質(zhì)更為穩(wěn)定，化合物的前期處理以及給藥非常方便。因此，在傳統(tǒng)擴(kuò) 增造血干細(xì)胞的方法中加入小分子化合物，甚至完全采用小分子化合物替代現(xiàn)有的血清、 細(xì)胞因子等物質(zhì)，可能對(duì)體外培養(yǎng)造血干細(xì)胞發(fā)揮重要作用。
[0008] 本發(fā)明旨在研宄制得一種新的pl8小分子抑制劑，并通過(guò)該pl8小分子抑制劑體 外培養(yǎng)人造血干細(xì)胞，以達(dá)到造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種P18小分子抑制劑及其在人造血 干細(xì)胞體外擴(kuò)增中的用途。
[0010] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0011] -種pl8小分子抑制劑，其結(jié)構(gòu)為：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種pl8小分子抑制劑，其特征在于：其結(jié)構(gòu)為：
2. 權(quán)利要求1所述pl8小分子抑制劑的制備方法，其特征在于：包括如下步驟： 在冰浴條件下，將環(huán)己胺和對(duì)羧基苯磺酰氯溶解在二氯甲烷中，加入三乙胺，攪拌1小 時(shí)，升至室溫后，繼續(xù)攪拌，TLC監(jiān)控反應(yīng)完成后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去反應(yīng)溶液，殘余物純化，得中 間體； 在冰浴條件下，將所得中間體溶解在水中，加入氫氧化鈉，升至室溫后，攪拌30分鐘， 所得反應(yīng)液真空凍干，得終產(chǎn)品。
3. 權(quán)利要求1所述pl8小分子抑制劑在人造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增中的用途。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于：所述用途中，pl8小分子抑制劑在擴(kuò)增培 養(yǎng)基中的濃度為10_50nM。
5. -種人造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增方法，其特征在于：包括如下步驟：將新鮮分離的人臍 帶血CD34+細(xì)胞使用擴(kuò)增培養(yǎng)基（StemSpanSFEM培養(yǎng)基 +[100ng/mL]SCF/TP0/Flt3L/ IL-6)重懸至細(xì)胞濃度為5X104細(xì)胞/mL，然后鋪于96孔板中，每孔為190yL細(xì)胞懸液， 隨后向其中添加10UL使用同種擴(kuò)增培養(yǎng)基稀釋過(guò)的pl8小分子抑制劑，pl8小分子抑制 劑的終濃度為20nM，在37°C，5%C02恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天。
【專利摘要】本發(fā)明涉及p18小分子抑制劑及在人造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增中的用途，其結(jié)構(gòu)為：本發(fā)明還提供了該p18小分子抑制劑的制備方法及用途，本發(fā)明p18小分子抑制劑對(duì)于人造血干細(xì)胞自我更新具有較好的促進(jìn)作用，可為日后臨床治療提供新的方法。
【IPC分類】C07C303-38, C12N5-0789, C07C311-20
【公開(kāi)號(hào)】CN104693075
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510081641
【發(fā)明人】程濤, 解向群, 高瀛岱, 楊鵬
【申請(qǐng)人】程濤, 解向群, 高瀛岱
【公開(kāi)日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2015年2月13日