裂殖壺菌sta-m-3及其應用和產(chǎn)生裂殖壺菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種原生質(zhì)體融合技術(shù)，特別涉及通過原生 質(zhì)體融合構(gòu)建直接利用淀粉生產(chǎn)DHA的新型裂殖壺菌的方法，特別涉及裂殖壺菌STA-M-3 及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] DHA(Docosahexaenoicacid，二十二碳六稀酸），是一種具有重要生理意義和經(jīng)濟 價值的多不飽和脂肪酸。DHA不僅是嬰幼兒大腦、視覺正常發(fā)育的必需物質(zhì)，而且在延緩老 年人大腦和視覺功能衰退、降低血脂、抑制血栓形成、調(diào)節(jié)免疫功能、抑制腫瘤、防治炎性疾 病等方面也有積極的作用。通過微生物發(fā)酵法制備DHA，與傳統(tǒng)魚油的來源相比，具有不飽 和脂肪酸成分單一、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、無魚腥味等諸多優(yōu)點，其發(fā)展前景廣闊。
[0003] 裂殖壺菌是生產(chǎn)DHA的理想菌株，其脂質(zhì)多不飽和脂肪酸組成簡單，主要是DHA和 DPA，其他多不飽和脂肪酸如EPA、AA含量不到0. 5%，而且它耐機械攪拌，對剪切力有較強 的耐受能力。通過條件優(yōu)化，發(fā)酵罐培養(yǎng)5天，生物量可達59. 2g/L，DHA產(chǎn)量可達15. 5g/ L〇
[0004] 國內(nèi)外的研宄主要集中在用裂殖壺菌以葡萄糖為底物高效發(fā)酵產(chǎn)DHA，但是葡萄 糖原料比較貴，導致產(chǎn)品價格比較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為此，本發(fā)明的目的之一是提供一種裂殖壺菌SchizochytriumSTA-M-3 ;
[0006] 本發(fā)明的又一目的是提供一種產(chǎn)生裂殖壺菌的方法；
[0007] 本發(fā)明的再一目的是提供一種利用裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法；本發(fā)明提供的裂殖 壺菌SchizochytriumSTA-M-3以淀粉為碳源生產(chǎn)DHA，解決了DHA產(chǎn)品價格比較高的問題。
[0008] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0009] -種裂殖壺菌SchizochytriumSTA-M-3,其分類命名為裂殖壺菌，所述裂殖壺菌 被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為：CGMCCNo. 9381，保 藏時間為：2014年6月25日，保藏單位地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科 學院微生物研宄所，本發(fā)明中稱為裂殖壺菌STA-M-3。
[0010] 一種產(chǎn)生所述裂殖壺菌的方法，包括如下步驟：
[0011] 步驟一、以裂殖壺菌B4D1和黑曲霉CGMCC3. 316作為兩親本，制備兩親本的原 生質(zhì)體；裂殖壺菌B4D1在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為： CGMCCNo. 8313,保藏單位地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物 研宄所，保藏日期為：2013年10月9日，分類命名為：括蝓形裂殖壺菌（Schizochytrium limacinum)。黑曲霉CGMCC3. 316在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保 藏號為：CGMCCNo. 8313,保藏單位地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院 微生物研宄所。
[0012] 步驟二、將兩親本的原生質(zhì)體融合；
[0013] 步驟三、將融合后的原生質(zhì)體接種于淀粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)，根據(jù)各個菌株的遺傳穩(wěn) 定性和菌落形態(tài)篩選得到如權(quán)利要求1所述的裂殖壺菌。裂殖壺菌的菌落為乳白、灰白或 米黃色，正面隆起，表面光滑、濕潤，菌落似凝脂狀。裂殖壺菌的顯微形態(tài)特征：營養(yǎng)細胞呈 圓形或橢圓形，直徑10-15tmi，內(nèi)有明顯油脂粒，分裂方式為二分裂方式，有二分體、四分體 等形態(tài)，有菌體聚集現(xiàn)象。
[0014] 優(yōu)選的是，產(chǎn)生所述裂殖壺菌的方法，所述步驟二中，首先將黑曲霉CGMCC3. 316 原生質(zhì)體在50~65°C下處理1~30min，之后再將兩親本原生質(zhì)體融合。50~65°C熱滅 活主要作用在細胞質(zhì)中，使核糖體或核糖體RNA受到損傷，結(jié)果使細胞內(nèi)的功能蛋白、酶蛋 白的合成受到影響或使其變性失活，產(chǎn)生致死作用。滅活的目的是為了標記融合子，即讓親 本黑曲霉原生質(zhì)體CGMCC3. 316全部致死，而經(jīng)過融合后所生長的即為融合二倍體。
[0015] 優(yōu)選的是，產(chǎn)生所述裂殖壺菌的方法中，所述淀粉培養(yǎng)基包含：淀粉5~10g/L、氮 源3~15g/L和海水晶10~30g/L;其中，所述氮源為玉米漿或酵母粉或蛋白胨中的任意 一種或幾種。
[0016] 較優(yōu)選的是，產(chǎn)生所述裂殖壺菌的方法中，所述淀粉培養(yǎng)基包含：淀粉5~10g/L、 蛋白胨2~10g/L、酵母粉1~5g/L和海水晶10~30g/L。
[0017] 更優(yōu)選的是，產(chǎn)生所述裂殖壺菌的方法中，所述淀粉培養(yǎng)基為使用高滲PBS緩沖 液配制的淀粉培養(yǎng)基，所述高滲PBS緩沖液中磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉的濃度為0. 2mol/L， 氯化鉀的濃度為0. 7mol/L。由于融合后的原生質(zhì)體的內(nèi)部滲透壓很高，使用高滲PBS緩沖 液配制的淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)，可維持原生質(zhì)體內(nèi)外滲透壓一致。
[0018] -種利用裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法，將該裂殖壺菌STA-M-3在淀粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 產(chǎn)生DHA。
[0019] 優(yōu)選的是，所述的方法中，所述淀粉培養(yǎng)基以海水或人工海水作為無機鹽來源，鹽 度約為15%，以淀粉作為碳源，濃度為5g/L，以玉米漿或酵母抽提物或蛋白胨作為氮源，濃 度為2g/L，在培養(yǎng)過程中pH在4-8范圍內(nèi)。
[0020] 優(yōu)選的是，所述的方法中，培養(yǎng)過程中，在28°C條件下培養(yǎng)7天。
[0021] 本發(fā)明得到的裂殖壺菌STA-M-3以淀粉作為碳源產(chǎn)生DNA，菌株不用在進行糖化 才能利用碳源，相對來說，縮短了DHA的生產(chǎn)周期，而且淀粉相對葡萄糖來說，來源廣、價格 低廉，因此本發(fā)明的裂殖壺菌STA-M-3的產(chǎn)生意義重大，在不改變原有生產(chǎn)工藝、不增加其 他設(shè)備投資的前提下降低生產(chǎn)成本；且裂殖壺菌STA-M-3遺傳穩(wěn)定性好，產(chǎn)物中不飽和脂 肪酸成分單一、產(chǎn)品DHA的質(zhì)量穩(wěn)定。
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發(fā)明所述的裂殖壺菌STA-M-3的油脂氣象色譜圖；
[0023] 圖2為引物對本發(fā)明所述的親本及其融合子的RAH)的擴增的圖譜，其中1是指親 本裂殖壺菌B4D1，2指的是融合子裂殖壺菌STA-M-3,3指的是黑曲霉CGMCC3. 316。
【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文 字能夠據(jù)以實施。
[0025] 實施例1 :
[0026] -種裂殖壺菌SchizochytriumSTA-M-3,其分類命名為裂殖壺菌，所述裂殖壺菌 被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為：CGMCCNo. 9381，保 藏時間為：2014年6月25日，保藏單位地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科 學院微生物研宄所。
[0027] 實施例2 :
[0028] 所述裂殖壺菌SchizochytriumSTA-M-3是以DHA高產(chǎn)菌株裂殖壺菌B4D1和能夠 高效利用淀粉黑曲霉CGMCC3. 316為出發(fā)菌株，利用滅活親本并用原生質(zhì)體融合的方式，使 雙親本原生質(zhì)體融合而再生，獲得同時具有親本性狀的菌株。
[0029] 一、實驗試劑和培養(yǎng)基：
[0030] 緩沖溶液PBS:磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉的濃度為0.2mol/L，pH5.8，121°C滅菌 20min〇
[0031] 高滲緩沖液HPBS:PBS緩沖液中添加0? 7mol/L的KC1。
[0032] 預處理劑：于PBS緩沖液中添加0. 1%EDTA，121°C滅菌20min。臨用前添加0. 3% 0-疏基乙醇。酶液：裂解酶（Lysingenzyme)購自Sigma公司（寫一下型號和規(guī)格比較 好）。稱取裂解酶，懸于HPBS中充分振蕩并靜置，使之完全溶解，至濃度為5mg/ml。經(jīng)0. 22y 微孔濾膜過濾除菌，保存于4°C冰箱備用。
[0033] PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂120g/L;
[0034] GYP液體培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白陳10g/L，酵母粉5g/L，海水晶15g/L，pH自 鋏.
[0035] 菌絲生長培養(yǎng)基：L2%葡萄糖，0? 2%KH2P04,0 . 05%MgS04,0 . 04%NaH2P04,0. 1% NH4N03,0. 1 % 微量元素（1. 1 %ZnS04,0. 1 %FeS04,0.6%MnS04,0 . 03 %CoC12,4%CuS04， 0. 06%H3BO3),pH5.8；
[0036] 淀粉培養(yǎng)基：可溶性淀粉5g/L，蛋白胨2g/L，酵母粉lg/L，海水晶10g/L，pH自然；
[0037] 高滲的淀粉培養(yǎng)基：使用HPBS溶液配制的淀粉培養(yǎng)基。
[0038] 二、實驗方法
[0039] 一種產(chǎn)生裂殖壺菌的方法，包括如下步驟：
[0040] (1)兩親本菌體的制備
[0041] 黑曲霉菌絲培養(yǎng)：
[0042] 將黑曲霉CGMCC3. 316的原始菌種轉(zhuǎn)接至PDA斜面固體培養(yǎng)基上，待孢子生長成熟 后，用PBS洗脫孢子，調(diào)整孢子濃度為108個/mL，以10% (v/v)的接種量接入菌絲生長培 養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝液量50mL，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間12~15h。 收集培養(yǎng)液，經(jīng)PBS緩沖液洗滌后置于盛有50mL離心管中，3500r/min離心lOmin。棄上清 液，保留菌絲體。
[0043] 裂殖壺菌菌體培養(yǎng)：
[0044] 裂殖壺菌B4D1以10% (v/v)的接種量，接種于GYP液體培養(yǎng)基，28°C、180r/min 條件下培養(yǎng)32~36h，4000r/min離心，用PBS緩沖液洗滌離心兩次，收集菌體。
[0045] (2)兩親本原生質(zhì)體的制備
[0046] 黑曲霉原生質(zhì)體的制備：
[0047] 向步驟（1)得到的黑曲霉菌絲體中按照lg菌絲體加入lmL裂解酶液裂解細胞壁 的酶，置于溫度為25~40°C的恒溫搖床中，50~150r/m