驟一、樣品采集：在豆豉制作工廠內(nèi)采集制曲過程中的豆豉，然后用樣品袋封裝，低 溫保藏。
[0020] 步驟二、富集培養(yǎng)：取樣品lg放入裝有10mL試管中，用漩渦振蕩器振蕩5min，吸 取lmL菌液置于裝有50mL肉湯培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，再放置在37±0. 1°C，170r/min 的搖床中72h。
[0021] 步驟三、菌株初篩：采用平板稀釋法，取富集培養(yǎng)出來的菌液200yL涂布在酪素 篩選培養(yǎng)基上，在37±0. 1°C培養(yǎng)48h，挑出能后產(chǎn)生透明圈的菌株，其中，產(chǎn)蛋白酶的解淀 粉芽孢桿菌的酪素篩選培養(yǎng)基為：干酪素1%，牛肉浸粉0. 3%，磷酸氫二鉀0. 2%，溴百里香酚 蘭0? 005%，瓊脂粉2%，pH為7. 4±0. 1左右。
[0022] 步驟四、菌株復(fù)篩：將初篩平板上有產(chǎn)生透明圈的單菌落用接種針點(diǎn)到酪素培養(yǎng) 基中，選擇透明圈直徑與菌落直徑比值（HC值）較大的菌落。
[0023] 步驟四，菌株分離純化：將復(fù)篩出來的菌株，接種于酪素培養(yǎng)基上平板上劃線，在 置于37°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，重復(fù)劃線三次以上，連續(xù)多次在顯微鏡下觀察到形態(tài) 單一的菌體說明菌株已經(jīng)分離純化。
[0024] 實(shí)施例2 :本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌株的顯微形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定 取所得透明圈最高的菌株進(jìn)行顯微形態(tài)和分子生物學(xué)方法鑒定，具體過程如下： (1)米用固體平板培養(yǎng)法：固體培養(yǎng)為肉湯培養(yǎng)基，37±1°C培養(yǎng)24h，菌落直徑8~ 12mm。呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落邊緣不規(guī)則，在多種培養(yǎng)基上均不產(chǎn)色素。
[0025] 解淀粉芽孢桿菌的顯微形態(tài)特征為：菌體呈短桿狀，染色均勻，具運(yùn)動(dòng)性，兼性厭 氧，可形成內(nèi)生芽孢，芽孢囊膨大，呈橢圓形，游離芽孢表面著色弱，革蘭氏染色陽性。解淀 粉芽孢桿菌菌落形態(tài)見附圖1，用番紅和孔雀綠染色后在100倍顯微鏡下觀察到的芽孢形 態(tài)和革蘭氏染色后再400倍顯微鏡下觀察到的菌體形態(tài)的顯微圖片見說明書附圖2和附圖 3〇
[0026] (2)分子生物學(xué)采用16SrDNA鑒定，取培養(yǎng)1天的發(fā)酵液，離心收集菌體，把所得 的菌體用試劑盒提取總DNA，利用細(xì)菌16SrDNA通用引物通過擴(kuò)增保守序列，將所得的序 列膠回收、純化、克隆，再送到上海生工測序，所得16SrDNA堿基序列如下： GGCAATGGCGGGCGTTCTATAATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGG
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株分離自豆豉中產(chǎn)蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌菌株，其特征在于：分類命名解淀粉 芽抱桿菌，拉丁文學(xué)名 Jxnuwy-1，已于 2014 年 12 月 10 日保 藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為：CCTCCM2014639;所述解淀粉芽孢桿菌菌株在 肉湯培養(yǎng)基上形態(tài)特征為：呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落邊緣不規(guī)則，在多種培養(yǎng)基 上均不產(chǎn)色素；所述解淀粉芽孢桿菌菌株顯微形態(tài)特征為：菌體呈短桿狀，染色均勻，具運(yùn) 動(dòng)性，兼性厭氧，可形成內(nèi)生芽孢，芽孢囊膨大，呈橢圓形，游離芽孢表面著色弱，革蘭氏染 色陽性；所述解淀粉芽孢桿菌16SrDNA堿基序列（基因登錄號KP419723): GGCAATGGCGGGCGTTCTATAATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGG ACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGT TGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAG TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGAC ACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGT GAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTG ACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGG AATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCA TTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGA GGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATT AGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAA CGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGG TGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAG GACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTC CCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCG GAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAA AGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGC GTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCG TCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGAACAGAT TG〇
2. 利用權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌菌株生產(chǎn)蛋白酶，其特征在于： :!：取解淀粉芽孢桿菌菌株，在無菌條件下，用接種環(huán)挑取少量菌落，接入已滅菌的肉 湯培養(yǎng)基平板，于37± 1°C活化培養(yǎng)24小時(shí)； S取活化培養(yǎng)后的菌種，無菌條件下，轉(zhuǎn)接入已滅菌的肉湯培養(yǎng)基中，在37±1°C， 170r/min下振蕩培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)好的菌液于酪素培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，菌液的裝液 量為30mL，在37±0. 1°C下振蕩培養(yǎng)48h; I：.發(fā)酵完畢，轉(zhuǎn)速l〇〇〇〇r/min下離心lOmin，獲得粗酶提取液，再進(jìn)行硫酸銨鹽析、脫 鹽、真空冷凍干燥后將所得的蛋白酶進(jìn)行SDS-PAGE電泳用以測定該蛋白酶的相對分子質(zhì) 量。
【專利摘要】本發(fā)明公布了一株分離自豆豉中產(chǎn)蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌菌株，屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。該菌是從傳統(tǒng)豆豉中分離純化技術(shù)分離獲得，經(jīng)微生物分類學(xué)鑒定命名為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），已于2014年12月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號：CCTCC M 2014639。本發(fā)明的產(chǎn)蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌菌株容易培養(yǎng)，生產(chǎn)安全性高，篩選所得菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)酶活達(dá)到148～2231U/mL，遺傳穩(wěn)定性好，其代謝產(chǎn)物蛋白酶容易分離純化，且其代謝產(chǎn)物蛋白酶的酶活性較高，為傳統(tǒng)豆豉工業(yè)實(shí)現(xiàn)科學(xué)化和的純種培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。CCTCC NO：M201463920141210
【IPC分類】C12N9-54, C12N1-20, C12R1-07
【公開號】CN104694424
【申請?zhí)枴緾N201510073251
【發(fā)明人】王筱蘭, 李保根, 涂宗財(cái), 楊林, 楊慧林
【申請人】江西師范大學(xué)
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年2月12日...