一種多粘類芽孢桿菌jx-13及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生物及用途，更具體地說(shuō)涉及一種多粘類芽孢桿菌 (Paenibacilluspolymyxa)JX-13、用途及其制劑的制備方法，屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前作物病害的防治仍主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，由此引起的病原菌抗藥性增加、環(huán)境 污染及果實(shí)的農(nóng)藥殘留問(wèn)題愈加突出，尋求安全有效的生物防治措施控制病害日益受到重 視。草莓枯萎病等土傳病害是國(guó)內(nèi)外草莓生產(chǎn)中難以防治的根部毀滅性病害，主要由尖孢 鐮刀菌（Fusariumoxysporum)等土傳病原真菌復(fù)合侵染導(dǎo)致，發(fā)病植株生長(zhǎng)發(fā)育受阻，產(chǎn) 量和品質(zhì)嚴(yán)重下降，已成為制約草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙。傳統(tǒng)利用溴甲烷等化學(xué)藥劑可 有效控制草莓根腐病的發(fā)生，但對(duì)土壤環(huán)境污染大，易產(chǎn)生病菌耐藥性及農(nóng)藥殘留等問(wèn)題， 已被世界大多數(shù)國(guó)家禁止使用。輪作和土壤消毒等農(nóng)藝措施雖有一定防治效果，但其生產(chǎn) 成本較大，難以適應(yīng)中國(guó)集約化農(nóng)業(yè)種植模式的要求。因此，篩選對(duì)草莓土傳病害有較強(qiáng)抗 性的生防菌并用于草莓生產(chǎn)，將會(huì)有效解決連作土傳病害，對(duì)草莓產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有 重要意義。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于草莓土傳微生物防治已有研宄報(bào)道。已分離獲得生防細(xì)菌、 放線菌及真菌。其中生防真菌主要為木霉屬（Trichoderma)和叢枝菌根真菌（AMF)，但在國(guó) 內(nèi)尚無(wú)在草莓上取得實(shí)際應(yīng)用的報(bào)道。
[0003] 草莓和葡萄的炭疽病、灰霉病，發(fā)生普遍，分布廣泛，是目前制約我國(guó)草莓和葡萄 產(chǎn)區(qū)的重要病害。在條件適宜發(fā)病時(shí)，可造成草莓、葡萄減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)40%以上。采 用田間管理和化學(xué)防治的方法防治雖然能取得一定的防治效果，但易產(chǎn)生抗藥性、而且有 環(huán)境污染和果實(shí)農(nóng)藥殘留。因此，尋找高效安全的替代防治方法顯得尤為迫切。生物防治 方法因其與環(huán)境友好、維持生態(tài)平衡、有利于人類健康等優(yōu)點(diǎn)而成為可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展中的 方向技術(shù)之一，已為越來(lái)越多生產(chǎn)者和種植者所接受。在國(guó)外，用生物學(xué)方法防治上述病 害已有所進(jìn)展。Freemanetal. (2004)用 4 種木霉菌Trichodermaharzianum、hamatum、 atroviride和longibrachiatum的提取物防治草莓、葡萄的炭疽病和灰霉病取得良好效 果。以色列MakhteshimAganChemicalWorks公司已將哈茨木霉harzianum開(kāi)發(fā)為真菌 生防制劑，并在以色列、歐洲和北美的20多個(gè)國(guó)家成功注冊(cè)。在我國(guó)，對(duì)草莓、葡萄等作物 生物防治的研宄相對(duì)滯后，僅有枯草芽孢桿菌等少數(shù)登記應(yīng)用。
[0004] 因草莓、葡萄是鮮食為主的應(yīng)時(shí)鮮果，所以對(duì)藥劑的選擇有一定的局限性。因此對(duì) 草莓、葡萄病害的生物防治在生產(chǎn)上具有一定迫切需求。本發(fā)明提供的頡頏細(xì)多粘類芽孢 桿菌JX-13菌株及制劑，在草莓、葡萄上防治病害上的應(yīng)用在現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有提及和公開(kāi)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的：為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是 提供了一株分離自石楠根部的內(nèi)生芽孢桿菌：多粘類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa) JX-13菌株，該菌株可用于防治草莓枯萎病、炭疽病、灰霉病和葡萄灰霉病、炭疽病。
[0006] 本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供了多粘類芽孢桿菌JX-13的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供了用該多粘類芽孢桿菌JX-13菌株加 工成可濕性粉劑及其制備方法。
[0008] 技術(shù)方案：為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種多粘類芽孢桿菌JX-13,其分 類命名為多粘類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa)，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心（簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏單位地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)， 中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所，郵政編碼為100101，保藏編號(hào)為：CGMCCNo. 9796,保藏日期為 2014年10月17日。
[0009] 其中，上述的多粘類芽孢桿菌JX-13在防治草莓枯萎病、草莓灰霉病、草莓炭疽 病、葡萄灰霉病和葡萄炭疽病方面的應(yīng)用。
[0010] 其中，上述的多粘類芽孢桿菌JX-13的發(fā)酵液制備而成的可濕性粉劑。
[0011] 其中，上述的可濕性粉劑的制備方法，包括以下步驟：
[0012] (A)菌液的獲得：用無(wú)菌芽簽挑取事先在PDA固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)好的JX-13 菌株單菌落斑，接種于裝有5mLPDA液體培養(yǎng)液的容積為20mL的三角瓶中，于30°C、200rpm 條件下振蕩培養(yǎng)16h，過(guò)夜得到培養(yǎng)液，將上步所得培養(yǎng)液5mL全部接種于裝有400mLPDA 培養(yǎng)液的容積為l〇〇〇mL的三角瓶中，200rpm、30°C條件下振蕩培養(yǎng)16h;把所得的400mL培 養(yǎng)液接種于裝有20L發(fā)酵培養(yǎng)液的容積為30L的發(fā)酵罐中發(fā)酵得到發(fā)酵液；
[0013] (B)菌劑加工工藝：將發(fā)酵好的發(fā)酵液按如下方法加工成可濕性粉劑：將發(fā)酵液 離心后用玉米淀粉吸干，測(cè)定活芽孢含量，根據(jù)測(cè)定結(jié)果用白炭黑和高嶺土調(diào)節(jié)活芽孢數(shù) 得到粉劑，終含量調(diào)節(jié)成芽孢含量為1.0XlcTcfu/克；將上述調(diào)節(jié)好粉劑進(jìn)入氣流粉碎機(jī) 并攪拌均勻，得成品為100億活芽孢/克的可濕性粉劑。
[0014] 其中，上述20L發(fā)酵培養(yǎng)液中固容物含量為：豆柏100g、馬鈴薯淀粉200g、蔗糖 25g、酵母粉25g、CaC0320g、MnS04l. 0g，設(shè)置發(fā)酵條件為：溶氧100%，攪拌速度為350rpm，發(fā) 酵溫度30 °C，發(fā)酵時(shí)間36h，pH7. 0-7. 2。
[0015] 其中，上述的可濕性粉劑在防治草莓枯萎病、草莓灰霉病、草莓炭疽病、葡萄灰霉 病和葡萄炭疽病方面的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明還包括上述的可濕性粉劑在防治草莓枯萎病方面的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明還包括上述的可濕性粉劑在防治草莓灰霉病方面的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明還包括上述的可濕性粉劑在防治葡萄灰霉病方面的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明還包括上述的可濕性粉劑在防治葡萄炭疽病方面的應(yīng)用。
[0020] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：
[0021] (1)本發(fā)明提供一株新的生防芽孢桿菌一一枯草芽孢桿菌JX-13菌株，由該菌株 發(fā)酵而制得的可濕性粉劑，能有效防治草莓枯萎病、炭疽病、灰霉病和葡萄灰霉病、炭疽病 等土傳病害。
[0022] (2)菌劑貯藏性質(zhì)穩(wěn)定，防治效果好，大規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低廉。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面列舉實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，但不因此限制本發(fā)明的內(nèi)容。
[0024] 實(shí)施例1
[0025] 獲得多粘類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa)JX-13菌株的方法如下：
[0026] PDA培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯（去皮）200g/L，葡萄糖20g/L，水1L，瓊脂20g/L，pH自 然。將馬鈴薯去皮，切成小塊，于鍋中加水約1L煮沸半個(gè)小時(shí)，用雙層紗布過(guò)濾，取其濾液 加葡萄糖，并加水補(bǔ)足1L。
[0027] 獲得菌株的方法包括以下步驟：
[0028] 1)菌株的分離、純化與保存。
[0029] 在位于江蘇省句容市陳武鎮(zhèn)的江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)博園內(nèi)的大葉石楠根部 土壤中采集樣品，在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌水將樣品稀釋后在PDA平皿上涂布并放置于30°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)菌的菌落特征及時(shí)挑取不同形態(tài)單菌落至PDA平皿上，純化2次，記 錄菌株號(hào)，將已純化的菌株轉(zhuǎn)到PDA斜面上培養(yǎng)好后放入4°C冰箱中備用。然后將上述分離 保存的細(xì)菌菌株轉(zhuǎn)接中PDA平皿上活化，采用平皿對(duì)峙培養(yǎng)法篩選草莓枯萎病、炭疽病、灰 霉病和葡萄灰霉病、炭疽病菌的拮抗菌株，根據(jù)抑菌圈的大小評(píng)定菌株的拮抗活性。
[0030] 2)鑒定菌株種屬并保藏。
[0031] 將拮抗活性最強(qiáng)的菌株傳代純化培養(yǎng)后，對(duì)菌株進(jìn)行分子鑒定，鑒定結(jié)果 顯示菌株為多粘類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa)，對(duì)其命名為多粘類芽孢桿 菌（Paenibacilluspolymyxa)JX-13 菌株，并制作多粘類芽抱桿菌（Paenibacillus po1ymyxa)JX-13菌株的冷凍干燥管進(jìn)行原始菌株的凍藏。
[0032] 本發(fā)明的多粘類芽孢桿菌JX-13,其分類命名為多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa)，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCC No. 9796,保藏日期為2014年10月17日。
[0033] 本發(fā)明的菌種具有如下特征：
[0034] (1)JX13菌株的細(xì)胞形態(tài)及生理生化特征（見(jiàn)表1)
[0035] 表1、細(xì)胞形態(tài)和理化試驗(yàn)結(jié)果
[0036]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種多粘類芽孢桿菌JX-13,其特征在于，其分類命名為多粘類芽孢桿菌 ，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保 藏編號(hào)為：CGMCCNo. 9796,保藏日期為2014年10月17日。
2. 權(quán)利要求1所述的多粘類芽孢桿菌JX-13在防治草莓灰霉病、草莓炭疽病、葡萄灰霉 病、葡萄炭疽病和草莓枯萎病方面的應(yīng)用。
3. 權(quán)利要求1所述的多粘類芽孢桿菌JX-13的發(fā)酵液制備而成的可濕性粉劑。
4. 權(quán)利要求3所述的可濕性粉劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (A) 菌液的獲得：用無(wú)菌芽簽挑取事先在PDA固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)好的JX-13菌株單 菌落斑，接種于裝有5mLPDA液體培養(yǎng)液的容積為20mL的三角瓶中，于30°C、200rpm條 件下振蕩培養(yǎng)16h，過(guò)夜得到培養(yǎng)液，將上步所得培養(yǎng)液5mL全部接種于裝有400mLPDA 培養(yǎng)液的容積為1000mL的三角瓶中，200rpm、30°C條件下振蕩培養(yǎng)16h;把所得的400mL 培養(yǎng)液接種于裝有20L發(fā)酵培養(yǎng)液的容積為30L的發(fā)酵罐中發(fā)酵得到發(fā)酵液； (B) 菌劑加工工藝：將發(fā)酵好的發(fā)酵液按如下方法加工成可濕性粉劑：將發(fā)酵液離心 后用玉米淀粉吸干，測(cè)定活芽孢含量，根據(jù)測(cè)定結(jié)果用白炭黑和高嶺土調(diào)節(jié)活芽孢數(shù)得到 粉劑，終含量調(diào)節(jié)成芽孢含量為I.OX101°cfu/克；將上述調(diào)節(jié)好粉劑進(jìn)入氣流粉碎機(jī)并 攪拌均勻，得成品為100億活芽孢/克的可濕性粉劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的可濕性粉劑的制備方法，其特征在于，所述20L發(fā)酵培養(yǎng)液中 固容物含量為：豆柏100g、馬鈴薯淀粉200g、蔗糖25g、酵母粉25g、CaCO3 20g、MnSO4 1.0g，設(shè)置發(fā)酵條件為：溶氧100%，攪拌速度為350rpm，發(fā)酵溫度30 °C，發(fā)酵時(shí)間36h， pH7. 0-7. 2 〇
6. 權(quán)利要求3所述的可濕性粉劑在防治草莓枯萎病、草莓灰霉病、草莓炭疽病、葡萄灰 霉病和葡萄炭疽病方面的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求3所述的可濕性粉劑在防治草莓枯萎病方面的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求3所述的可濕性粉劑在防治草莓灰霉病方面的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求3所述的可濕性粉劑在防治葡萄灰霉病方面的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求3所述的可濕性粉劑在防治葡萄炭疽病方面的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種多粘類芽孢桿菌JX-13，其分類命名為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCC No.9796，保藏日期為2014年10月17日。本發(fā)明還公開(kāi)了上述多粘類芽孢桿菌JX-13的應(yīng)用。本發(fā)明的多粘類芽孢桿菌JX-13，由該菌株發(fā)酵而制得的可濕性粉劑，能有效防治草莓枯萎病、炭疽病、灰霉病和葡萄灰霉病、炭疽病等病害。菌劑貯藏性質(zhì)穩(wěn)定，防治效果好，大規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低廉。CGMCC No.979620141017
【IPC分類】A01N25-14, C12R1-01, A01N63-00, C12N1-20, A01P3-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104694446
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510150619
【發(fā)明人】吉沐祥, 陳宏州, 吳祥, 趙桂華, 楊敬輝, 郭建, 毛妮妮
【申請(qǐng)人】江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所
【公開(kāi)日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2015年3月31日