用于有效生產(chǎn)琥珀酸和蘋(píng)果酸的材料和方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于有效生產(chǎn)琥珀酸和蘋(píng)果酸的材料和方法
[0001] 本申請(qǐng)為2008年3月19日提交的，發(fā)明名稱(chēng)為"用于有效生產(chǎn)琥珀酸和蘋(píng)果酸的 材料和方法"的PCT申請(qǐng)PCT/US2008/057439的分案申請(qǐng)，所述PCT申請(qǐng)進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段 的日期為2009年9月18日，申請(qǐng)?zhí)枮?00880008975. 1。
[0002] 與相關(guān)申請(qǐng)交叉參考
[0003] 本申請(qǐng)主張2007年3月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)No. 60/895, 806的權(quán)益， 其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)整體引用作為參考，包括所有的圖、表格和氨基酸或核酸序列。
[0004] 政府支持
[0005] 根據(jù)授權(quán)號(hào)USDOE-DEFG02-96ER20222 下由能源部（D印artmentofEnergy) 授權(quán)的，和授權(quán)號(hào)USDA&DOEBiomassRDIDEFG36-04G014019下由能源部與美國(guó)農(nóng)業(yè)部 (UnitedStatesDepartmentofAgriculture)聯(lián)合授權(quán)的政府支持，完成了本發(fā)明。政府 對(duì)本發(fā)明具有某些權(quán)利。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 隨著石油價(jià)格的提高，從可更新的原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸會(huì)越來(lái)越有競(jìng)爭(zhēng)力。琥珀 酸可作為底物用于轉(zhuǎn)化成塑料、溶劑和目前由石油制成的其他化學(xué)品（Lee等，2004;Lee 等，2005;McKinlay等，2007;Wendisch等，2006;Zeikus等，1999)。許多細(xì)菌被描述為具有 生產(chǎn)琥珀酸作為主要發(fā)酵產(chǎn)物的天然能力（美國(guó)專(zhuān)利號(hào)No. 5, 723, 322;表1)。然而，通常 需要復(fù)雜的工藝、復(fù)雜的培養(yǎng)基和長(zhǎng)久的孵育時(shí)間。
[0008] 先前已使用多種遺傳手段改造大腸桿菌菌株（Escherichiacoli)用于生產(chǎn)琥泊 酸，并取得了不同程度的成功（表1)。在大部分研宄中，達(dá)到的滴度較低，并且需要復(fù)雜 的培養(yǎng)基成分例如酵母提取物或玉米漿。菌株NZN111以每摩爾被代謝的葡萄糖0.98摩 爾瑭I自酸的摩爾產(chǎn)率生產(chǎn)108mM瑭I自酸（Chatterjee等，2001 ;Millard等，1996;Stols 和Donnelly，1997)。該菌株如下改造得到：使兩個(gè)基因失活（編碼丙酮酸-甲酸裂解酶 的pflB和編碼乳酸脫氫酶的ldhA)并過(guò)表達(dá)來(lái)自多拷貝質(zhì)粒的兩個(gè)大腸桿菌基因：磷酸 烯醇丙酮酸羧化酶（ppc)和蘋(píng)果酸脫氫酶（mdh)。菌株HL27659k如下改造得到：突變琥 I白酸脫氫酶（sdhAB)、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（pta)、乙酸激酶（ackA)、丙酮酸氧化酶（poxB)、葡 萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ptsG)和異檸檬酸裂合酶阻抑物（iclR)。該菌株生產(chǎn)少于100mM的琥珀 酸并需要氧受限制的發(fā)酵條件（Cox等，2006 ;Lin等，2005a，2005b，2005c;Yun等，2005)。 使用在計(jì)算機(jī)芯片上的代謝分析設(shè)計(jì)基因敲除，從而在大腸桿菌中創(chuàng)建與Mannheimia succiniciproducens中的天然琥泊酸途徑相似的途徑（Lee等，2005和2006)。然而得到的 菌株生產(chǎn)非常少的琥珀酸。Andersson等，（2007)報(bào)道了僅含有天然基因的經(jīng)改造的大腸 桿菌琥珀酸生產(chǎn)的最高水平（339mM)。
[0009] 其他研宄人員從事的是在大腸桿菌中表達(dá)異源基因的備選途徑。從多拷貝質(zhì)粒中 過(guò)表達(dá)Rhizobiumeteloti丙酮酸羧化酶（pyc)，從而指導(dǎo)碳流向琥I自酸（Gokarn等，2000 ; Vemuri等，2002a，2002b)。如下構(gòu)建菌株SBS550MG:使異檸檬酸裂合酶阻抑物（iclR)、 adhE、ldhA和ackA失活，并從多拷貝質(zhì)粒中過(guò)表達(dá)枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)的 citZ(朽1檬酸合酶）和R.etlipyc(Sanchez等，2005a)。使用該菌株，以1. 6的摩爾產(chǎn)率從 葡萄糖生產(chǎn)160mM琥珀酸。
[0010] 也研宄了用于琥珀酸生產(chǎn)的更復(fù)雜的工藝（表1)。許多這些工藝包括需氧生 長(zhǎng)期，之后是厭氧生產(chǎn)期。厭氧期通常用二氧化碳、氫或二者提供（Andersson等，2007;Sanchez等，2005a和 2005b;Sanchez等，2006 ;美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5, 869, 301;Vemuri等，2002a和 2002b)。在使用天然琥I自酸生產(chǎn)者產(chǎn)琥I自酸厭氧螺菌（A.succiniciproducens)的近期研 宄中，組合了電滲析、C02的噴射、細(xì)胞再循環(huán)和分批補(bǔ)料（Meynial-Salles等，2007)。
[0011] 本發(fā)明提供了在礦物鹽培養(yǎng)基中，在簡(jiǎn)單的、pH-受控的、分批發(fā)酵期間，以高滴度 和產(chǎn)率生產(chǎn)琥珀酸而不需要異源基因或質(zhì)粒的多種形式的微生物，例如大腸桿菌菌株。在 開(kāi)發(fā)期間，中間體菌株的特征是生產(chǎn)蘋(píng)果酸作為優(yōu)勢(shì)產(chǎn)物。
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 本發(fā)明提供了適用于生產(chǎn)乳酸的新微生物，例如大腸桿菌。因此，本發(fā)明的材料和 方法可被用于生產(chǎn)適用于多種應(yīng)用的琥珀酸和蘋(píng)果酸。
[0014] 在某些實(shí)施方案中，大腸桿菌的衍生物（在本文中也稱(chēng)作大腸桿菌）可被用于構(gòu) 建生產(chǎn)琥珀酸、蘋(píng)果酸和丙氨酸的菌株。在多種實(shí)施方案中，大腸桿菌C(例如ATCC 8739) 可同大腸桿菌的任何其他菌株一樣被使用，所述任何其他大腸桿菌菌株可得自多種保藏單 位或商業(yè)來(lái)源。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的經(jīng)改造的微生物也僅含有天然基因（即不含 有來(lái)自其他生物的遺傳材料）。根據(jù)下文的描述會(huì)容易地明了本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)。
[0015] 附圖概沐
[0016] 圖1A-1B.葡萄糖成為琥珀酸的發(fā)酵。圖1A顯示通過(guò)大腸桿菌發(fā)酵葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn) 途徑。該途徑已由Unden和Kleefeld(2004)重新畫(huà)出。粗體箭頭表示中樞發(fā)酵途徑。十字 代表為了改造KJ012在該研宄中進(jìn)行的基因缺失（ldhA，adhE，ackA)?；蚝兔福簂dhA，乳酸 脫氫酶；pflB，丙酮酸-甲酸裂解酶；focA，甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；pta，磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶；ackA， 乙酸激酶；adhE，醇脫氫酶；ppc，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；pdh，丙酮酸脫氫酶復(fù)合物；gltA， 梓檬酸合酶；mdh，蘋(píng)果酸脫氫酶；fumA，fumB和fumC，延胡索酸酶異構(gòu)酶；frdABCD，延胡索 酸還原酶；fdh，甲酸脫氫酶；icd，異朽1檬酸脫氫酶；acs，乙?；鶁CoA合成酶；mgsA，甲基 乙二醛合酶；P〇xB，丙酮酸氧化酶；aldA，醛脫氫酶；和aldB，醛脫氫酶。圖1B顯示經(jīng)改造的 大腸桿菌菌株中，ATP生產(chǎn)和生長(zhǎng)與琥珀酸和蘋(píng)果酸生產(chǎn)的偶合。實(shí)線箭頭連接NADH池。 虛線箭頭連接NAD+池。在厭氧條件下的糖酵解期間，生長(zhǎng)與ATP的生產(chǎn)和NADH的氧化專(zhuān) 性偶合。
[0017] 圖2A-2D.大腸桿菌對(duì)琥珀酸生產(chǎn)的可能的羧化途徑。編碼關(guān)鍵性羧化酶的基因 以粗體顯示。圖2A顯示PEP羧化酶。磷酸烯醇丙酮酸（PEP)不生產(chǎn)ATP。這被認(rèn)為是葡萄 糖發(fā)酵期間大腸桿菌生產(chǎn)琥珀酸的主要途徑。
[0018] 圖2B顯示蘋(píng)果酸酶（NADH)。在丙酮酸激酶（pykA或pykF)從ADP和PEP生產(chǎn)ATP 期間，能量被保存。蘋(píng)果酸酶（sfcA)催化NADH-相關(guān)的還原性羧化，從而生產(chǎn)蘋(píng)果酸。圖 2C顯示蘋(píng)果酸酶（NADPH)。在丙酮酸激酶（pykA或pykF)從ADP和PEP生產(chǎn)ATP期間，能 量被保存。蘋(píng)果酸酶（maeB)催化NADPH-相關(guān)的還原性羧化，從而生產(chǎn)蘋(píng)果酸。圖2D顯示 PEP羧激酶（carboxykinase)。在PEP的羧化期間通過(guò)生產(chǎn)ATP保存能量，從而生產(chǎn)草酰乙 酸。
[0019] 圖3A-3C.KJ012代謝演化期間產(chǎn)生KJ017、KJ032和KJ060的生長(zhǎng)。將菌株KJ012 連續(xù)地轉(zhuǎn)移進(jìn)含5% (w/v)(圖3A)和10% (w/v)(圖3B)葡萄糖的NBS培養(yǎng)基中，分別產(chǎn) 生KJ017。缺失focA和pflB后，將得到的菌株（KJ032)最初在補(bǔ)充有乙酸的培養(yǎng)基中繼代 培養(yǎng)（圖3C)。乙酸水平被降低并隨后在進(jìn)一步傳遞中被消除，以生產(chǎn)KJ060。折線代表無(wú) 乙酸時(shí)KJ017的發(fā)酵，添加作為比較。符號(hào)：0D55(lnm處的光密度魯。
[0020] 圖4A-4F.用于生產(chǎn)琥珀酸和蘋(píng)果酸的菌株的代謝演化期間，發(fā)酵產(chǎn)物的概述。如 所示用乙酸鈉補(bǔ)充培養(yǎng)物。黑色的箭頭代表在文本所示發(fā)酵條件之間的轉(zhuǎn)換。在KJ032的 代謝演化期間未檢測(cè)到甲酸和僅檢測(cè)到小量乳酸。在KJ070和KJ072的代謝演化期間未檢 測(cè)到甲酸和乳酸。圖4A(5%w/v葡萄糖）和圖4B(10%w/v葡萄糖），KJ012到KJ017;圖 4C(5%w/v葡萄糖）和圖 4D(10%w/v葡萄糖），KJ032 到KJ060 ;圖 4E，10%葡萄糖，KJ070 到KJ071 ;圖4F，10%葡萄糖，KJ072到KJ073。所有圖的符號(hào)：，琥珀酸；□，甲酸；A，乙 酸；▲，蘋(píng)果酸；?，乳酸；和▼，丙酮酸。
[0021] 圖5.總結(jié)大腸桿菌C的遺傳改造和代謝演化中步驟的簡(jiǎn)圖，所述大腸桿菌C作為 琥珀酸和蘋(píng)果酸生產(chǎn)的生物催化劑。該過(guò)程代表了 261次連續(xù)傳代，其提供了超過(guò)2000個(gè) 基于生長(zhǎng)選擇的世代。從每種方案的最終培養(yǎng)物中分離克隆并指定菌株名稱(chēng)，顯示于表3 中的圓括號(hào)內(nèi)。
[0022] 圖6.葡萄糖的發(fā)酵和相關(guān)途徑。中樞代謝指出在被改造用于生產(chǎn)琥珀酸的構(gòu) 建體中缺失的基因。實(shí)線箭頭表述中樞發(fā)酵途徑。虛線箭頭表示丙酮酸氧化成為乙酸 (P〇xB)的微需氧途徑。點(diǎn)線箭頭顯示在需氧代謝期間正常發(fā)揮作用的途徑、丙酮酸脫氫 酶（pdh)和乙醛酸支路（aceAB)。帶框的十字代表用于構(gòu)建KJ012和KJ017的三個(gè)初始基 因缺失（ldhA，adhE，ackA)。簡(jiǎn)單的十字標(biāo)記了構(gòu)建KJ017衍生物期間缺失的額外基因： KJ032(ldhA，adhE，ackA，focA，pflB)，和KJ070(ldhA，adhE，ackA，focA，pflB，mgsA)，和 KJ072 (ldhA，adhE，ackA，focA，pflB，mgsA，poxB)?；蚝兔福簂dhA，乳酸脫氛酶；focA，甲酸 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；pflB，丙酮酸-甲酸裂解酶；pta，磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶；ackA，乙酸激酶；adhE，醇 脫氫酶；ppc，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；pdh，丙酮酸脫氫酶復(fù)合物；gltA，檸檬酸合酶;mdh， 蘋(píng)果酸脫氫酶；fumA，fumB和fumC，延胡索酸酶異構(gòu)酶；frdABCD，延胡索酸還原酶；fdh，甲 酸脫氫酶；mgsA，甲基乙二醛合酶；gloAB，乙二醛酶I和II;poxB，丙酮酸氧化酶；aceA，異 朽1檬酸裂合酶；aceB，蘋(píng)果酸合酶；acnAB，順烏頭酸酶；和acs，乙酰~CoA合成酶。
[0023] 圖7A-7C.通過(guò)大腸桿菌C的衍生物在礦物鹽培養(yǎng)基（10 %葡萄糖）中生產(chǎn)琥珀 酸和蘋(píng)果酸。圖7A顯示AM1培養(yǎng)基中由KJ060生產(chǎn)琥珀酸。圖7B顯示AM1培養(yǎng)基中由 KJ073生產(chǎn)琥珀酸。圖7C顯示在NBS培養(yǎng)基中由KJ071生產(chǎn)蘋(píng)果酸。發(fā)酵以33mgDCWr1 的水平接種。所有圖的符號(hào)：〇，葡萄糖；魯，琥珀酸；，蘋(píng)果酸；A，細(xì)胞量。
[0024] 圖8.pL0I4162的構(gòu)建。與pEL04和pL0I4152相關(guān)聯(lián)的短實(shí)線箭頭表示用于DNA 擴(kuò)增的引物。
[0025] 圖9.KJ073中的琥珀酸生產(chǎn)途徑。編碼該研宄中涉及琥珀酸生產(chǎn)的主要羧化 酶一一磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因以反轉(zhuǎn)形式顯示。實(shí)線箭頭指出期望在葡萄糖的 厭氧發(fā)酵期間有功能的反應(yīng)。實(shí)線十字指出缺失的基因。帶框的十字代表用于構(gòu)建琥珀酸 生產(chǎn)初始菌株KJ017的關(guān)鍵缺失（ldhA，adhE，ackA)。虛線表示PoxB將丙酮酸氧化為乙酸， 這是通常僅在微需氧條件下有功能的過(guò)程。點(diǎn)線表示主要與需氧代謝相關(guān)的反應(yīng)?；?和酶：ldhA，乳酸脫氫酶；pflB，丙酮酸-甲酸裂解酶；focA，甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；pta，磷酸乙酰 基轉(zhuǎn)移酶；ackA，乙酸激酶；ad