一種用于篩選抗骨質(zhì)疏松藥物的細(xì)胞共培養(yǎng)模型及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/破骨前體細(xì)胞/卵泡顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)模型進(jìn)行抗骨質(zhì)疏松藥物篩選的模型及其應(yīng)用
【背景技術(shù)】
[0002]隨著社會(huì)老齡化的進(jìn)程，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，目前全球有2億骨質(zhì)疏松患者，并且女性多于男性。中國(guó)老年人居于世界首位，現(xiàn)有骨質(zhì)疏松患者9000萬，占總?cè)丝诘?.1%。預(yù)計(jì)到2050年，全球骨質(zhì)疏松患者將增加到2.21億，那時(shí)全世界一半以上的骨質(zhì)疏松性骨折將發(fā)生在亞洲，絕大部分在中國(guó)。日趨嚴(yán)峻的骨質(zhì)疏松發(fā)病情況提示，臨床現(xiàn)用的抗骨質(zhì)疏松藥物效果并不理想，因此開發(fā)新的抗骨質(zhì)疏松藥物的任務(wù)迫在眉睫。
[0003]近年來研究資料表明，骨重建失衡是骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵致病因素。當(dāng)破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收超過成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成，致使骨量減少、骨多孔、脆性增加，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。國(guó)內(nèi)外大量研究結(jié)果表明成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞通過相互耦聯(lián)促進(jìn)彼此功能。破骨細(xì)胞表面表達(dá)RANK，與成骨細(xì)胞表達(dá)的RANKL結(jié)合，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，激活骨吸收功能。除了細(xì)胞間受體和配體的直接相互作用外，一些分泌型的調(diào)控因子也間接調(diào)控彼此活性。如破骨細(xì)胞的兩個(gè)分泌蛋白BMP6和WntlOb增加，促進(jìn)了成骨細(xì)胞成熟。在去勢(shì)大鼠模型上證明雌激素缺乏，導(dǎo)致成骨和破骨細(xì)胞表達(dá)的雌激素受體α、β比例發(fā)生改變。成骨和破骨細(xì)胞的相互作用并非成熟階段開始，對(duì)于它們來源的前體骨髓細(xì)胞，這種相互調(diào)控機(jī)理既已發(fā)生。破骨細(xì)胞自身能夠表達(dá)磷酸鞘胺醇(SlP)和ΒΜΡ6，刺激成骨細(xì)胞前體一骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSC Wnt/BMP信號(hào)途徑，促使MSC募集，定向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨形成?？紤]到維持骨重建的穩(wěn)定并非由成骨或破骨細(xì)胞各自獨(dú)立完成，而是由骨組織調(diào)節(jié)成骨和破骨細(xì)胞功效的前體細(xì)胞共同參與，卵巢組織的卵泡顆粒細(xì)胞釋放雌激素的間接調(diào)控作用亦日益受到人們的關(guān)注。
[0004]目前,抗骨質(zhì)疏松藥物主要有骨吸收抑制劑,包括雙磷酸鹽、雌激素、雌激素受體調(diào)節(jié)劑等，骨形成制劑，包括甲狀腺旁激素。但是，由于成骨和破骨細(xì)胞的耦聯(lián)作用，單獨(dú)抑制骨吸收或骨形成均會(huì)引起副作用。長(zhǎng)期服用雙磷酸鹽會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致骨喪失。長(zhǎng)期服用甲狀腺旁激素會(huì)增加骨癌的危險(xiǎn)性。因此開發(fā)既能抑制骨吸收又能增強(qiáng)骨形成的多靶點(diǎn)藥物備受關(guān)注，但是一直沒有取得突破。
[0005]已有文獻(xiàn)報(bào)道中抗骨質(zhì)疏松藥物體外評(píng)價(jià)模型主要以單細(xì)胞為主，如鼠成骨細(xì)胞增殖分化模型、RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化模型、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞模型等。以及以酶學(xué)研究為基礎(chǔ)的模型，如組織蛋白酶K(cath印sin K)等。上述體外模型并不能較為全面的模擬體內(nèi)骨重建耦聯(lián)情況，作為藥物篩選的評(píng)價(jià)手段有所缺陷。而調(diào)節(jié)骨重建藥物的體內(nèi)動(dòng)物模型評(píng)價(jià)方法主要采用:如灌服糖皮質(zhì)激素、灌胃維甲酸誘導(dǎo)法或雙側(cè)卵巢切除法誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型等，動(dòng)物模型雖然能夠更為貼切的模擬骨重建異常的情況，但是周期長(zhǎng)、花費(fèi)大，不適合藥物的前期發(fā)現(xiàn)階段的快速評(píng)估研究，本領(lǐng)域急需建立新的篩選方式。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]發(fā)明目的本發(fā)明提供一種能夠快速篩選抗骨質(zhì)疏松藥物的細(xì)胞模型。
[0007]技術(shù)方案
[0008]一種抗骨質(zhì)疏松藥物篩選的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/破骨前體細(xì)胞/卵泡顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)模型，其特征在于包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和破骨前體細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)，卵泡顆粒細(xì)胞非接觸式共培養(yǎng)，按如下步驟制得:
[0009]A、取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在300 μ L培養(yǎng)容器中，培養(yǎng)容器中部橫向設(shè)有直徑為
0.4-3微米的帶孔半透膜，分為上下兩層培養(yǎng)室，下室中加入80-120 μ L的含體積濃度10?20%胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)液，細(xì)胞密度為0.1?I X 15個(gè)/ml的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，待其貼壁后換為含10?100nM地塞米松、I?1mM β -甘油磷酸鈉、5?50 μ M磷酸維生素c及含體積濃度20%胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；再培養(yǎng)7?8d后，棄上清，加入破骨前體細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)液，培養(yǎng)液加入量80-120 μ L，細(xì)胞密度為0.1?I X 15個(gè)/ml，待其貼壁后換為含10?100nM地塞米松、I?1mMβ-甘油磷酸鈉、5?50 μ M磷酸維生素C、20?100ng/ml RANKL及含體積濃度10?20%胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；繼續(xù)培養(yǎng)2?4d后，再將細(xì)胞密度為0.1?I X 15個(gè)/ml的50-120 μ L的卵泡顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液加入上層培養(yǎng)室，將培養(yǎng)容器中所有的培養(yǎng)液換為無血清的a -MEM培養(yǎng)液，置35?37°C，于通入有體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2空氣的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)I?2d。
[0010]一種權(quán)利要求1所述的細(xì)胞共培養(yǎng)模型在進(jìn)行抗骨質(zhì)疏松藥物篩選中的應(yīng)用，
[0011 ] 在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/破骨前體細(xì)胞/卵泡顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)模型的共培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液內(nèi)，在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁后給予0.01?200μ g/ml的待篩選藥物，以未加藥組作為空白對(duì)照組；
[0012]在培養(yǎng)箱中35?37°C，通入有體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2空氣進(jìn)行靜置培養(yǎng)12?14d后，收集40?100 μ L上清液和上層培養(yǎng)室的卵泡顆粒細(xì)胞裂解液10?20 μ L，檢測(cè)50?120 μ L溶液的雌二醇的含量；
[0013]下層培養(yǎng)室的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體用檸檬酸-丙酮溶液固定，染色法檢測(cè)堿性磷酸酶ALP表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)；細(xì)胞再次洗滌后，以ρΝΡΡ作為底物檢測(cè)抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP活力；
[0014]與未加藥組相比，第一種情況:增加ALP值、同時(shí)減少或不影響TRAP值、升高或不影響雌二醇值；第二種情況:減少TRAP值，同時(shí)增加或不影響ALP值、升高或不影響雌二醇值；以上兩種情況可認(rèn)定具有調(diào)節(jié)骨重建活性，可作為骨質(zhì)疏松的候選藥物。否則不能作為骨質(zhì)疏松的候選藥物；此模型可應(yīng)用于中藥提取物或任一化合物的篩選。
[0015]待篩選藥物于培養(yǎng)液內(nèi)中的濃度在0.001?200 μ g/ml范圍內(nèi)取4_10個(gè)以上的不同劑量值分別進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng)模型的藥物篩選，且每個(gè)劑量值取2個(gè)以上的細(xì)胞共培養(yǎng)模型做為重復(fù)的平行實(shí)驗(yàn)組。
[0016]按照權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:檢測(cè)指標(biāo)的含量范圍為雌二醇50-120pg/ml,下層培養(yǎng)室底面積為0.32cm2的培養(yǎng)容器中ALP陽性細(xì)胞數(shù)為1_40個(gè)/培養(yǎng)容器，培養(yǎng)容器底面積為0.32cm2的培養(yǎng)容器中405nm波長(zhǎng)下TRAP吸光度值為0.1-2.0。
[0017]有益效果
[0018]1、本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/破骨前體細(xì)胞/卵泡顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)體系，是在上下兩層培養(yǎng)系統(tǒng)中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和破骨前體細(xì)胞培養(yǎng)在下層培養(yǎng)室的底面上，卵泡顆粒細(xì)胞培養(yǎng)在上層培養(yǎng)室的半透膜上:該培養(yǎng)體系是在體外條件下模擬卵巢組織對(duì)骨重建的調(diào)控作用，并以藥物對(duì)雌二醇、堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶的影響，應(yīng)用于抗骨質(zhì)疏松藥物的快速篩選。
[0019]本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/破骨前體細(xì)胞/卵泡顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)體系作為篩選模型，與整體動(dòng)物模型相比，具有快速培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)；與單種細(xì)胞模型相比，在保持了快速培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，不但同時(shí)提供了多個(gè)調(diào)節(jié)骨重建的相關(guān)靶點(diǎn)用于篩選藥物，又較為真實(shí)地模擬了體內(nèi)骨重建及其卵巢組織對(duì)骨組織的調(diào)控作用，有效避免了漏篩某些通過卵巢組織間接調(diào)控骨重建的藥物。
[0020]2、通過采用臨床抗骨質(zhì)疏松一線藥物阿倫磷酸鈉和甲狀腺旁激素PTHh4和已知活性化合物淫羊藿苷對(duì)該模型進(jìn)行測(cè)試，我們認(rèn)定藥物作用效果與體內(nèi)作用效果更為接近。共培養(yǎng)體系中，與未加藥組相比，增加ALP值、同時(shí)又能減少TRAP值、升高或不影響雌二醇值可認(rèn)定具有調(diào)節(jié)骨重建作用。
【附圖說明】
[0021]圖1為上下兩層培養(yǎng)室中共培養(yǎng)的示意圖，其中I為兩層培養(yǎng)室的上層，2為兩層培養(yǎng)室的下層；
[0022]圖2原代培養(yǎng)的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和大鼠卵泡顆