體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為紅系細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于再生醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及紅系細(xì)胞的制備方法，尤其是一種體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向紅系細(xì)胞分化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著我國(guó)醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展和人們生活要求的日益增高，成分輸血在臨床醫(yī)療實(shí)踐中不斷深入，其中紅系細(xì)胞(也稱血細(xì)胞)的用量最大。紅系細(xì)胞輸注已是現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)中至關(guān)重要的細(xì)胞治療手段，目的主要是改善患者的缺氧狀態(tài)，廣泛應(yīng)用于術(shù)后及外傷、慢性貧血及其他多種疾病的治療。但目前臨床上仍然依賴志愿者無(wú)償獻(xiàn)血這一途徑為主要血液來(lái)源，血液供應(yīng)非常緊張，血液供應(yīng)不足的報(bào)道經(jīng)常見于報(bào)紙、電視和網(wǎng)絡(luò)等各種媒體。目前隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷改進(jìn)，輸血引起的傳染病發(fā)生率已經(jīng)非常低，但是仍時(shí)有發(fā)生。這些問題對(duì)臨床輸血應(yīng)用的安全性和廣泛性帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，因此尋找更為安全和經(jīng)濟(jì)的血液來(lái)源一直是輸血醫(yī)學(xué)研宄的重要方向，人們將目光投向了體外生產(chǎn)紅系細(xì)胞，紅系細(xì)胞的體外制備可按需要生產(chǎn)特定血型，并可最大限度地避免輸血相關(guān)傳染疾病的發(fā)生等。
[0003]目前已開發(fā)了多種紅系細(xì)胞代用品，主要包括血紅蛋白氧載體和氟碳類化合物兩大類。然而血紅蛋白氧載體穩(wěn)定性差、純化困難、工藝復(fù)雜而且成本高，氟碳類化合物攜氧能力弱，代謝慢，并且有很大的毒副作用，因此這兩類紅系細(xì)胞替代品尚不能大規(guī)模的應(yīng)用，需要繼續(xù)尋找新的血液紅系細(xì)胞替代來(lái)源。近年來(lái)干細(xì)胞及其應(yīng)用已成為世界生命科學(xué)研宄的熱點(diǎn)之一，以干細(xì)胞為技術(shù)平臺(tái)的相關(guān)研宄在細(xì)胞治療、胚胎發(fā)育、新基因的功能研宄、基因治療、藥物篩選和新藥藥理研宄等領(lǐng)域都顯現(xiàn)出誘人的應(yīng)用前景。
[0004]干細(xì)胞在體外具有自我更新和多向分化能力，其獨(dú)有的特性:1)高度的自我更新能力，在體外具有接近無(wú)限的增殖能力；2)發(fā)育分化的全能性；3)遺傳的可操作性，使得其作為體外誘導(dǎo)分化的種子細(xì)胞具有明顯的優(yōu)勢(shì)。以人胚胎干細(xì)胞體外定向分化為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療可能為很多疾病的治療帶來(lái)希望，其中將人胚胎干細(xì)胞在體外大規(guī)模誘導(dǎo)分化為成熟紅細(xì)胞可作為新的血液替代來(lái)源有可能為解決目前臨床輸血治療面臨的問題帶來(lái)希望，將具有廣泛的應(yīng)用前景和重大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。
[0005]目前，體外誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為成熟紅系細(xì)胞并最終應(yīng)用于臨床還有很多關(guān)鍵的技術(shù)問題需要解決，包括如何安全低成本的由人胚胎干細(xì)胞向造血干細(xì)胞分化，如何高效率誘導(dǎo)造血干細(xì)胞向紅系細(xì)胞分化，如何保證誘導(dǎo)分化成熟的紅系細(xì)胞是否能夠在體內(nèi)發(fā)揮功能，誘導(dǎo)獲得紅細(xì)胞的安全性和免疫排斥等問題。在以上問題中，本發(fā)明首次建立以胚胎干細(xì)胞為啟動(dòng)細(xì)胞定向誘導(dǎo)生成紅系細(xì)胞的體外制備方法，擬通過(guò)解決其中兩個(gè)關(guān)鍵性技術(shù)問題，即在體外實(shí)現(xiàn)安全低成本的由人胚胎干細(xì)胞向造血干細(xì)胞分化和體外無(wú)血清培養(yǎng)體系下高效率的由造血干細(xì)胞定向分化為紅系細(xì)胞。希望通過(guò)解決以上兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)問題使人胚胎干細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞分化能夠更安全、高效，為最終為由胚胎干細(xì)胞獲得滿足臨床輸血需要的紅系細(xì)胞進(jìn)行技術(shù)儲(chǔ)備。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是，提供一種取材方便、易于體外擴(kuò)增、免疫源性低的體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向紅系細(xì)胞分化的方法。
[0007]為了解決上述技術(shù)問題，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明的體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為紅系細(xì)胞的方法，采用含有地塞米松的誘導(dǎo)體系對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)，進(jìn)而采用含有無(wú)血清培養(yǎng)添加劑N2或B27、前列腺素E2和L-谷氨酰胺的無(wú)血清培養(yǎng)基體系誘導(dǎo)培養(yǎng)，然后采用含有干細(xì)胞因子(SCF)、白介素3、促紅細(xì)胞生成素的無(wú)血清培養(yǎng)基體系誘導(dǎo)分化成紅系細(xì)胞。
[0008]本發(fā)明方法分化的紅系細(xì)胞是一種用于失血、缺血、體液?jiǎn)适В枰皶r(shí)補(bǔ)充人體所必需的膠體溶液的來(lái)源，由人胚胎干細(xì)胞在體外定向分化形成，并可通過(guò)靜脈輸注的方法替代血液制品。
[0009]本發(fā)明方法分化形成的紅系細(xì)胞表面標(biāo)記物⑶36陽(yáng)性表達(dá)率為90%以上。
[0010]進(jìn)一步的，所述的體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為紅系細(xì)胞的方法，其特征是由下述步驟組成:
(1)胚胎干細(xì)胞體外常規(guī)培養(yǎng)；
(2)胚胎干細(xì)胞的預(yù)誘導(dǎo):采用由添加了0.1mM地塞米松的含雙抗的DMEM/F-12完全培養(yǎng)基制備而成的誘導(dǎo)體系I培養(yǎng)；
(3)預(yù)誘導(dǎo)的細(xì)胞定向分化成造血干細(xì)胞:采用包括體積比例濃度為2%的N2或B27、含雙抗的無(wú)血清StemSpan ? ACF培養(yǎng)基，并添加了 20ng/ml前列腺素E2、2mM的L-谷氨酰胺制備而成誘導(dǎo)體系II培養(yǎng)；
(4)造血干細(xì)胞定向分化成紅系細(xì)胞:采用包括體積比例濃度為2%的N2或B27、含雙抗的的無(wú)血清StemSpan ? ACF培養(yǎng)基，并添加了 0.1mM干細(xì)胞因子(SCF)、0.15mM白介素3,0.05mM促紅細(xì)胞生成素制備而成的誘導(dǎo)體系III培養(yǎng)。
[0011]進(jìn)一步的，所述的步驟(I)具體包括以下步驟:常規(guī)培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行傳代和擴(kuò)增，此階段培養(yǎng)基為:85%DMEM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加15% Knockout SerumReplacement，lmmol/L必需氨基酸，100IU/mL青霉素，50 μ g/mL鏈霉素和4ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。細(xì)胞培養(yǎng)在37°C，5%的二氧化碳條件下孵化，每周傳代一次。
[0012]進(jìn)一步的，所述的步驟(2)具體包括以下步驟:為了誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向造血細(xì)胞的分化，在培養(yǎng)6?7天對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。用lmg/mL IV型膠原酶在37°C下消化3?5min吹打成小細(xì)胞團(tuán)，然后使用超低黏附6孔培養(yǎng)板懸浮7天，第I?5天采用含體積比例濃度為100IU/mL青霉素，50 μ g/mL鏈霉素的DMEM/F-12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2天換液一次，在培養(yǎng)的第5天采用添加預(yù)誘導(dǎo)因子0.1mM地塞米松的誘導(dǎo)體系I培養(yǎng)2?3天，置于37 °C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0013]進(jìn)一步的，所述的步驟(3)具體包括以下步驟:將上述步驟(2)預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞移至0.1%明膠包被的96孔組織培養(yǎng)板。采用誘導(dǎo)體系II，可避免因添加血清而可能帶來(lái)的異源污染，置37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6?8天，每2天補(bǔ)液一次?’每7天換液一次，貼壁培養(yǎng)后，每天在光學(xué)顯微鏡下觀察培養(yǎng)皿中細(xì)胞生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)20天后獲得由胚胎干細(xì)胞定向分化成的造血干細(xì)胞。
[0014]進(jìn)一步的，所述的步驟(4)具體包括以下步驟:
第一步，將上述步驟(3)制備干細(xì)胞進(jìn)行經(jīng)流式檢測(cè)，⑶34陽(yáng)性細(xì)胞比例為90%以上，滿足下一步對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)的要求；
第二步，通過(guò)免疫磁珠法成功分離出CD34陽(yáng)性細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液1.0ml，浸入覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察見細(xì)胞呈圓形漂起時(shí)，加入1.0ml胎牛血清中止消化；
第三步，加入1ml PBS反復(fù)吹打沖洗，在室溫下900轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；棄去上清液后，加入1ml無(wú)血清誘導(dǎo)體系III重懸細(xì)胞，重新接種在培養(yǎng)皿中；
第四步，將上述培養(yǎng)皿置37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6?8天，每3天補(bǔ)液一次；每7天換液一次，培養(yǎng)20天后獲得由造血干細(xì)定向分化而來(lái)的紅系細(xì)胞，收集紅系細(xì)胞并進(jìn)行流式檢測(cè)，結(jié)果顯示⑶36陽(yáng)性表達(dá)率為90%以上。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明誘導(dǎo)方法首次實(shí)現(xiàn)體外由胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)生成造血干細(xì)胞，繼而在進(jìn)行又到生成紅系細(xì)胞。通過(guò)本發(fā)明方法制備的造血干細(xì)胞和紅系細(xì)胞特異表達(dá)性高，造血干細(xì)胞⑶34陽(yáng)性表達(dá)率由現(xiàn)有技術(shù)的85%提升到90%，紅系細(xì)胞⑶36陽(yáng)性表達(dá)率由現(xiàn)有技術(shù)的86%提升到90%以上；且首次建立以胚胎干細(xì)胞為啟動(dòng)細(xì)胞定向誘導(dǎo)生成紅系細(xì)胞的體外制備方法，具有較強(qiáng)的創(chuàng)造性。
[0016]本發(fā)明方法進(jìn)一步提供了充足、安全、有效和經(jīng)濟(jì)的細(xì)胞來(lái)源，更有利于擴(kuò)大血液輸注應(yīng)用；且中間誘導(dǎo)生成的造血干細(xì)胞同樣具有向紅細(xì)胞和血小板細(xì)胞分化的能力，對(duì)于血液疾病如白血病的治療也提供了一種新的造血干細(xì)胞的來(lái)源；誘導(dǎo)使用的干細(xì)來(lái)源于胚胎干細(xì)胞，取材方便、易于體外擴(kuò)增、免疫原性低。由于生理學(xué)特點(diǎn)基本一致，所以無(wú)論何種來(lái)源的人類干細(xì)胞，都適用本發(fā)明所提供的誘導(dǎo)方法。
【附圖說(shuō)明】
[0017]此處所說(shuō)明的附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中:
圖1是體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為紅系細(xì)胞的技術(shù)方案實(shí)施流程圖；
圖2是加不同濃度的前列腺素E2和L-谷氨酰胺培養(yǎng)造血紅細(xì)