從成人外周血中自動化提取免疫細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及從血液特別是外周血中自動分離免疫細(xì)胞的方法及其在治療疾病中的應(yīng)用，具體涉及從健康人體的血液中特別是外周血中自動分離免疫細(xì)胞并凍存，以及在出現(xiàn)免疫低下或發(fā)生疾病癥狀時(shí)，將免疫細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增并施用于患者進(jìn)行免疫細(xì)胞治療的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫細(xì)胞(immune cell)是白細(xì)胞的俗稱，包括淋巴細(xì)胞和各種吞噬細(xì)胞，也特指能識別抗原、產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的基本成分，在體內(nèi)分布很廣泛。研宄發(fā)現(xiàn)血液中蘊(yùn)含豐富的淋巴細(xì)胞，由于這類細(xì)胞具有免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)，所以一直受到人們的關(guān)注。淋巴細(xì)胞具有自然殺傷和自我保護(hù)的特性，針對病毒、細(xì)菌、真菌感染的治療均起到關(guān)鍵的作用，在癌癥的治療中具有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0003]免疫細(xì)胞在健康人體的血液中蘊(yùn)含豐富，但由于年齡老化、亞健康、罹患疾病等原因，血液中的免疫細(xì)胞數(shù)目會顯著降低，增殖分化能力亦大幅度衰退；而其他健康人的免疫細(xì)胞移植給患者則可能引起免疫排斥反應(yīng)；提取免疫細(xì)胞過程對患者的損傷性和在采集時(shí)遇到的其他問題，都直接影響了免疫細(xì)胞的臨床應(yīng)用，使得尋找一種穩(wěn)定可靠的免疫細(xì)胞獲取來源成為一個(gè)重要的問題。
[0004]研宄顯示，健康人的新鮮血液中含有大量有效的免疫細(xì)胞并且能有效分離，這種組織來源的免疫細(xì)胞不僅保持了免疫細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答的生物學(xué)特性，而且分離出來的免疫細(xì)胞具有原始的、強(qiáng)勁的增殖能力，同時(shí)還易于冷凍保存和復(fù)蘇。由于免疫細(xì)胞起源于自身，大大減低了觸發(fā)免疫反應(yīng)及引起移植物抗宿主病的風(fēng)險(xiǎn)。潛伏性病毒和微生物的感染及傳播幾率比較低。采集過程簡單，對健康的被采集者無任何危害及損傷。以上原因足以令從血液中分離免疫細(xì)胞成為獲得免疫細(xì)胞的有效途徑。
[0005]但是，目前關(guān)于血液免疫細(xì)胞的分離和擴(kuò)增方法不一，且大多步驟復(fù)雜，獲得較多數(shù)量血液免疫細(xì)胞也存在一定困難，同時(shí)患者在罹患疾病時(shí)采集血液存在一定風(fēng)險(xiǎn)。因此，本領(lǐng)域需要有從血液中分離、保存和擴(kuò)增免疫細(xì)胞的簡單、有效的方法，以滿足醫(yī)藥、科研、臨床應(yīng)用等領(lǐng)域的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)提取、凍存、復(fù)蘇血液免疫細(xì)胞方法的缺陷，提供一種簡單有效的血液免疫細(xì)胞的提取方法，以及相配套使用的凍存和復(fù)蘇的方法，以及復(fù)蘇后免疫細(xì)胞擴(kuò)增的方法。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)使用特定操作步驟的提取、凍存、復(fù)蘇以及擴(kuò)增，可以有效地獲得免疫細(xì)胞。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)而得以完成。
[0007]本發(fā)明方法中使用到一種稱為AXP(Auto Xpress Platform)的全自動細(xì)胞分離設(shè)備，其是美國TG公司(ThermoGenesis)制造的，TG公司是全球范圍內(nèi)專業(yè)從事干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)相關(guān)醫(yī)療設(shè)備與技術(shù)開發(fā)的國際領(lǐng)導(dǎo)型企業(yè)。公司研發(fā)的AXP、B1Archive等干細(xì)胞全自動化技術(shù)設(shè)備，獲得國際干細(xì)胞行業(yè)的廣泛認(rèn)可，并已得到美國食品藥品管理局(FDA)和美國血庫協(xié)會(AABB)等行業(yè)管理機(jī)構(gòu)與協(xié)會的認(rèn)同。目前，世界最大的CBR私人血庫，紐約NYBC公共血庫以及臺灣、香港等地區(qū)的170多家血庫都紛紛弓I進(jìn)他們的設(shè)備，全面實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞技術(shù)自動化。AXP全自動干細(xì)胞分離設(shè)備根據(jù)國際干細(xì)胞、血庫的行業(yè)技術(shù)要求設(shè)計(jì)發(fā)明的，不僅能全密閉式分離干細(xì)胞，將污染程度降到最低點(diǎn)，還能將干細(xì)胞的質(zhì)量從手工采集的70%提升到98.7%。自動化將是國內(nèi)干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)技術(shù)的一個(gè)里程碑。
[0008]本發(fā)明第一方面提供了從健康哺乳動物的新鮮血液中獲取免疫細(xì)胞的方法，具體提供了從成人外周血中自動化提取免疫細(xì)胞的方法，該方法包括以下分離步驟:
[0009](a)全血樣本預(yù)處理:將采集的成人外周血血樣，轉(zhuǎn)移至AXP處理袋中，加入羥乙基淀粉溶液放置在搖床上充分混勻(其中血樣與羥乙基淀粉溶液的混合體積比為2?6:1，例如3?5:1，例如4:1)；
[0010](b)自動分離^fAXP處理袋放入AXP全自動細(xì)胞分離設(shè)備后，進(jìn)行自動分離；
[0011](c)單個(gè)核細(xì)胞(在本文中可用縮寫MNC表示)收集:由AXP全自動細(xì)胞分離設(shè)備自動分離得到的免疫細(xì)胞自動收集于AXP全自動細(xì)胞分離設(shè)備內(nèi)所附的凍存袋中；
[0012]以及任選的下列步驟:
[0013](d)針對步驟(C)所得免疫細(xì)胞，檢測以下項(xiàng)目的至少一項(xiàng):單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)、單個(gè)核細(xì)胞活率、細(xì)胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型。
[0014]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，該方法還包括以下對提取的免疫細(xì)胞進(jìn)行凍存的步驟:
[0015](e)單個(gè)核細(xì)胞凍存:向步驟(C)提取的免疫細(xì)胞中加入凍存液，重懸免疫細(xì)胞，將免疫細(xì)胞加入凍存容器，程序降溫，然后再將凍存容器置于液氮罐中長期儲存；
[0016]以及任選的下列步驟:
[0017](f)建立包含步驟以上信息的免疫細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫，并使該數(shù)據(jù)庫與步驟(e)的凍存免疫細(xì)胞進(jìn)行關(guān)聯(lián)。
[0018]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，該方法還包括以下對凍存的免疫細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇的步驟:
[0019](g)細(xì)胞復(fù)蘇:將步驟(e)凍存的凍存容器從液氮罐中取出，水浴，清洗凍存容器表面后轉(zhuǎn)移至生物安全柜中，將免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)移至裝有培養(yǎng)基的離心容器中，重懸，混勻，補(bǔ)加培養(yǎng)基，離心洗滌；
[0020]以及任選的下列步驟:
[0021](h)針對步驟(g)所得復(fù)蘇的免疫細(xì)胞，檢測以下項(xiàng)目的至少一項(xiàng):單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)、單個(gè)核細(xì)胞活率及復(fù)蘇率、細(xì)胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型。
[0022]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，該方法還包括以下對復(fù)蘇的免疫細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增的步驟:
[0023](i)細(xì)胞擴(kuò)增:用含有培養(yǎng)基和血清的細(xì)胞培養(yǎng)液對復(fù)蘇后的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行重懸培養(yǎng)，吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至離心容器，反復(fù)吹洗貼壁細(xì)胞，直至貼壁細(xì)胞完全不被吹洗下來，獲得未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)，添加培養(yǎng)基重懸未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)，將離心容器中的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行離心處理，獲得的細(xì)胞沉淀為細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)，針對iDC細(xì)胞和CIK細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，再分別針對iDC細(xì)胞及CIK細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
[0024]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，所述哺乳動物是人。例如是成年人。
[0025]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，所述新鮮血液是外周血。
[0026]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，所述羥乙基淀粉溶液中羥乙基淀粉的濃度為4-8%，例如5-7%，例如6%。
[0027]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，所述羥乙基淀粉溶液是將羥乙基淀粉添加到0.9%氯化鈉溶液中配制得到的。
[0028]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，所述羥乙基淀粉溶液中還包含麥芽糖。
[0029]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，所述羥乙基淀粉溶液中還包含麥芽糖，麥芽糖的濃度為0.2?2%，特別是0.25?1.5%，特別是0.5?1%。已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，在用AXP全自動細(xì)胞分離設(shè)備進(jìn)行從外周血中自動分離免疫細(xì)胞時(shí)，使用添加了適量麥芽糖的羥乙基淀粉溶液稀釋血樣后，免疫細(xì)胞的收率至少可以提高15%，這具有極其重大的臨床意義。
[0030]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(b)中在AXP全自動細(xì)胞分離設(shè)備中進(jìn)行自動分離時(shí)，執(zhí)行兩次離心處理，第一次離心條件為:1430rcf、20min、15°C，第二次離心條件為:80rcf、10min、15°C。眾所周知，rcf (relative centrifugal force)系指相對離心力。
[0031]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(a)中，轉(zhuǎn)移至AXP處理袋中的血液留取5ml血樣于15ml離心容器中，用于血型檢測。
[0032]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(d)所述的檢測單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)和單個(gè)核細(xì)胞活率是向步驟(c)收集的細(xì)胞沉淀中加入10-30ml生理鹽水，優(yōu)選20ml，用1ml移液管反復(fù)吹吸細(xì)胞，充分混勻，吸取20 μ I細(xì)胞，加入180 μ I臺盼藍(lán)染液，充分混勻后加入計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞總數(shù)與活率，記錄結(jié)果。
[0033]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(e)所述的凍存液是按照20-60重量份的X-VIVO無血清培養(yǎng)基、10-50重量份的人血清白蛋白和5-15重量份的DMSO的配方配制而成的，優(yōu)選X-VIVO無血清培養(yǎng)基的配方量為30重量份、40重量份或50重量份，優(yōu)選人血清白蛋白的配方量為20重量份、30重量份或40重量份，優(yōu)選DMSO的配方量為8重量份、10重量份或12重量份。在一個(gè)實(shí)施方案中，凍存液中含有約50重量份的X-VIVO無血清培養(yǎng)基、約40重量份的人血清白蛋白和約10重量份的DMSO的凍存液。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，含有約50重量份的X-VIVO無血清培養(yǎng)基、約40重量份的人血清白蛋白和約10重量份的DMSO的凍存液是特別優(yōu)選的，比之于使該凍存液的任一成分含量變化10%以上的配方在提高冷凍效果、保護(hù)冷凍細(xì)胞等效果方面具有顯著優(yōu)勢。
[0034]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(e)所述的凍存液配置10_20ml，優(yōu)選15ml,放置于0-7 0C冰箱中備存，優(yōu)選4 V。
[0035]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(e)所述的重懸免疫細(xì)胞是將步驟(C)獲得的細(xì)胞沉淀按照2X 105-2X 109/ml的密度用凍存液充分混勾，優(yōu)選2X 107/ml的密度。
[0036]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述的凍存容器為凍存管，優(yōu)選2ml的凍存管。
[0037]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(e)所述的將免疫細(xì)胞加入凍存容器后，將凍存容器用封口膜封口，并標(biāo)示免疫細(xì)胞的相關(guān)信息，優(yōu)選標(biāo)示免疫細(xì)胞來源的標(biāo)簽。
[0038]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(e)所述的程序降溫是將凍存容器放入程序降溫裝置(優(yōu)選程序降溫盒)中，放入0-7°C (優(yōu)選4°C)冰箱中備用，轉(zhuǎn)移至-100°C至-40 °C (優(yōu)選-80 °C )的冰箱中儲存20-36小時(shí)(優(yōu)選24小時(shí))，再將凍存容器從程序降溫裝置中取出。在一個(gè)實(shí)施方案中，凍存容器取出后，程序降溫裝置放入4°C冰箱以備下一次使用。
[0039]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(e)所述凍存容器置于液氮罐中長期儲存，同時(shí)記錄樣本儲存的位置。
[0040]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(g)所述水浴是將從液氮中取出的凍存容器迅速放入水浴裝置(優(yōu)選水浴鍋)中實(shí)施的。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述水浴裝置的溫度在體溫附近，優(yōu)選37°C。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述凍存容器在水浴裝置中反復(fù)震蕩5-15次，優(yōu)選8-10次，震蕩時(shí)間控制在5min以內(nèi)，優(yōu)選控制在2min以內(nèi)。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，直至看到凍存容器中只剩下一團(tuán)冰晶后從水浴裝置中取出凍存容器。
[0041]根據(jù)本發(fā)明第一方