一種新型神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)添加劑及篩選方法、應(yīng)用及利用該添加劑的培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)添加劑，尤其是一種新型神經(jīng)干細(xì) 胞培養(yǎng)添加劑及篩選方法、應(yīng)用及利用該添加劑的培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞（stemcell)是身體內(nèi)的原始未分化細(xì)胞，而神經(jīng)干細(xì)胞（neuralstem cell，NSC)和神經(jīng)前體（母）細(xì)胞（neuralprecursorcell，NPC，是初級(jí)分化的神經(jīng)干細(xì) 胞）是神經(jīng)系統(tǒng)的干細(xì)胞。因?yàn)槠湓谥委熒窠?jīng)系統(tǒng)疾病和損傷中的廣闊使用前景，近年來(lái) 的研宄和臨床應(yīng)用突飛猛進(jìn)地發(fā)展。而神經(jīng)干系統(tǒng)應(yīng)用最首要的是能夠在體外成功地培養(yǎng) 并獲得增殖神經(jīng)干細(xì)胞。因?yàn)樯窠?jīng)是機(jī)體中最復(fù)雜和最高度分化的組織，神經(jīng)干細(xì)胞的培 養(yǎng)難度極高，在培養(yǎng)過(guò)程中極其容易自發(fā)分化，從而很快就失去干細(xì)胞的特性和功能。所以 培養(yǎng)基的優(yōu)化是必須的，也是極為困難的。
[0003] 目前最簡(jiǎn)單的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM及DMEM/F12 (1:1)和堿性 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF)，表皮生長(zhǎng)因子（EGF)內(nèi)加入N2培養(yǎng)添加劑。N2添加劑的成 分比較簡(jiǎn)單，含有細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的0. 025暈克/毫升胰島素，0. 1暈克/毫升轉(zhuǎn)鐵蛋白以 及20微摩爾孕酮，100微摩爾腐胺，和30毫微摩爾亞硒酸鈉（BottensteinandSato)。但 是因?yàn)槠渲锌偟鞍缀康停胰狈σ恍┘?xì)胞生長(zhǎng)的需求物，因此不能完全滿足現(xiàn)有的神 經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)的使用需求。
[0004] 目前，解決N2培養(yǎng)添加劑存在的問(wèn)題，最廣泛使用的是在上述神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng) 基的基礎(chǔ)上加入B27培養(yǎng)添加劑。但是，B27添加劑原本是為培養(yǎng)神經(jīng)元設(shè)計(jì)的（Brewer etal.)，其成分相當(dāng)復(fù)雜，且包含皮質(zhì)酮、視黃醇和三碘-L-甲狀腺原氨酸（T3)，這些成分 已被證明為會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞（neuralstemcell，NSC)和神經(jīng)前體（母）細(xì)胞（neural precursorcell，NPC)分化的成分。還有一些B27成分并非神經(jīng)干細(xì)胞所需的，或是已經(jīng) 被N2所提供。
[0005] 其中，上述B27添加劑成分如下：生物素，左旋肉堿，膽固醇，皮質(zhì)酮，乙醇胺， D(+) _半乳糖，谷胱甘肽，卵磷脂，亞油酸，亞麻酸，磷脂酰膽堿，孕酮，腐胺，視黃醇，視黃醇 乙酸酯，亞硒酸鈉，三碘-L-甲狀腺原氨酸（T3)，DL_a-維生素E，牛血清白蛋白，過(guò)氧化氫 酶，胰島素，超氧化物歧化酶，轉(zhuǎn)鐵蛋白。
[0006] 通過(guò)檢索，尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)相關(guān)的專(zhuān)利公開(kāi)文獻(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種設(shè)計(jì)科學(xué)、配方簡(jiǎn)單、成本 低廉、經(jīng)濟(jì)合理，并能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖而降低其向膠質(zhì)細(xì)胞分化的新型神經(jīng)干細(xì)胞培 養(yǎng)添加劑及篩選方法、應(yīng)用及利用該添加劑的培養(yǎng)基。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0009] -種新型神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)添加劑，其組成成分及最終使用濃度為：
[0010] 牛血清白蛋白1暈克/毫升，生物素50暈微克/毫升，左旋肉堿1微克/毫升，乙 醇胺〇. 5微克/毫升，D⑴-半乳糖7. 5微克/毫升，谷胱甘肽0. 1微摩爾和亞硒酸鈉30毫 微摩爾。
[0011] 利用如上所述的新型神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)添加劑的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中添加新型神 經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)添加劑。
[0012] 而且，其組成成分及比例如下：
[0013] DMHM培養(yǎng)基和DMEM/F12培養(yǎng)基的合成培養(yǎng)基，其中DMHM和DMEM/F12的體積比 為 1:1 ;
[0014]N2培養(yǎng)添加劑，N2培養(yǎng)添加劑的成分和使用濃度：0. 025毫克/毫升胰島素，0. 1 毫克/毫升轉(zhuǎn)鐵蛋白，20微摩爾孕酮，100微摩爾腐胺和30毫微摩爾亞硒酸鈉；
[0015] 10暈微克/毫升堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和20暈微克/毫升表皮生長(zhǎng)因子；
[0016] 以及上述新型神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)添加劑。
[0017] 如上所述的新型神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)添加劑在培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞方面的應(yīng)用。
[0018] 而且，所述神經(jīng)干細(xì)胞為哺乳動(dòng)物的神經(jīng)干細(xì)胞。
[0019] -種如上所述的新型神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)添加劑的篩選方法，步驟如下：
[0020] ⑴挑選B27培養(yǎng)添加劑中成分組成一個(gè)簡(jiǎn)化培養(yǎng)添加劑配方，該配方的最終使用 濃度含有牛血清白蛋白1毫克/毫升，生物素50毫微克/毫升，左旋肉堿1微克/毫升，乙 醇胺〇. 5微克/毫升，D⑴-半乳糖7. 5微克/毫升，谷胱甘肽0. 1微摩爾和亞硒酸鈉30毫 微摩爾；然后在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上比較該簡(jiǎn)化培養(yǎng)添加劑和B27培養(yǎng)添加劑對(duì)神經(jīng)干細(xì) 胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用；之后再在簡(jiǎn)化培養(yǎng)添加劑的基礎(chǔ)上逐個(gè)加入其它B27中成分以測(cè)定其 是否有添加效果；
[0021] ⑵細(xì)胞培養(yǎng)：
[0022] 1)解剖取材妊娠12. 5天和13. 5之間胚胎小鼠的大腦皮質(zhì)（el2. 5-13. 5);
[0023] 2)DMEM洗滌培養(yǎng)后神經(jīng)組織一次，在10單位/毫升木瓜蛋白酶和4毫克/毫升 DNA酶溶液中，37°C消化45分鐘；
[0024] 3)加入4毫克/毫升DNA酶后用吸管輕輕地吹打5-7次以分散組織；
[0025] 4)在1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，再懸浮于無(wú)鈣鎂的Hanks平衡鹽溶液中清洗；重 復(fù)三次后，將制成的單細(xì)胞懸液經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定細(xì)胞密度；
[0026] 5)按5X104/平方厘米的密度將細(xì)胞懸浮在含有新型簡(jiǎn)化培養(yǎng)添加劑的神經(jīng)干 細(xì)胞完全培養(yǎng)基中，接種于24孔培養(yǎng)板中；細(xì)胞培養(yǎng)板先涂覆過(guò)15毫微克/毫升多聚鳥(niǎo) 氨酸，然后是3毫微克/毫升的纖維連接蛋白；在37°C5%C02水套式二氧化碳培養(yǎng)箱里培 養(yǎng)；
[0027] 6)每?jī)商熳骺偭克姆种囵B(yǎng)基的換液，直至細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板時(shí)，一般需要6-7 天，即可用來(lái)進(jìn)行3H_胸腺嘧啶核苷摻入法來(lái)測(cè)定小鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖；
[0028] 7)為了用免疫細(xì)胞化學(xué)染色來(lái)決定培養(yǎng)中各種分化后細(xì)胞所占的比例，需要在細(xì) 胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板時(shí)全部換用新鮮培養(yǎng)基并撤除堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和表皮生長(zhǎng)因子以 促使干細(xì)胞分化成為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞；四天后用4%多聚甲醛固定之后作免疫細(xì)胞化學(xué) 染色；
[0029] ⑶3H_胸腺嘧啶核苷摻入法來(lái)測(cè)定小鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖：
[0030] 首先向培養(yǎng)液中加入0. 5毫微居里/毫升3H-胸腺嘧啶核苷并孵育24小時(shí)；用 10%三氯乙酸沉淀細(xì)胞的DNA10分鐘，在室溫和10%三氯醋酸洗滌兩次后，用0. 2摩爾氫氧 化鈉在室溫下提取DNA樣品10分鐘，所述DNA樣品含4毫克％切碎的DNA;同液體閃爍液 混合后在液體閃爍計(jì)數(shù)儀上測(cè)量同位素放射量；
[0031] ⑷免疫細(xì)胞化學(xué)染色來(lái)決定培養(yǎng)中各種細(xì)胞的比例
[0032] 用4%多聚甲醛在室溫固定細(xì)胞培養(yǎng)25分鐘，用磷酸緩沖鹽水（PBS)洗滌三次； 對(duì)于細(xì)胞內(nèi)抗原的染色，在〇. 1%TritonX-100中破細(xì)胞膜30分鐘，接著在5%正常山羊 血清孵育30分鐘以阻斷非特異性結(jié)合；在室溫孵育2小時(shí)；使用抗體是小鼠單克隆抗-微 管蛋白用于染神經(jīng)元，1:750稀釋?zhuān)枚嗫寺】笹FAP用于染星形膠質(zhì)細(xì)胞（1:400);小鼠單 克隆抗04用于染少突膠質(zhì)細(xì)胞及其前體細(xì)胞（1:10);用PBS洗三次后，在生物素標(biāo)記的羊 抗鼠IgG二抗中孵育1小時(shí)；用PBS洗三次后，在鏈霉親和素堿性磷酸酶溶液孵育30分鐘； 最后用底物BCIP/NBT顯示顏色；在倒置顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)；
[0033] 所述各種細(xì)胞的比例是細(xì)胞數(shù)量比；
[0034] (5)選取具有最強(qiáng)的促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的簡(jiǎn)化培養(yǎng)添加劑配方，即得新型神經(jīng)干 細(xì)胞培養(yǎng)添加劑的篩選方法。
[0035] 而且，所述步驟中⑴中的基本培養(yǎng)基的組成是：DMEM和DMEM/F12(體積比為1:1) 合成培養(yǎng)基，加N2培養(yǎng)添加劑和10暈微克/毫升堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和20暈微克/ 毫升表皮生長(zhǎng)因子；
[0036] 其中，所述N2培養(yǎng)添加劑按1:100體積比從商售濃縮液稀釋于合成培養(yǎng)基中。
[0037] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：
[0038] 1、本發(fā)明添加劑設(shè)計(jì)科學(xué)、配方簡(jiǎn)單、成本低廉、經(jīng)濟(jì)合理，并能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞 增殖而降低其向膠質(zhì)細(xì)胞分化，該培養(yǎng)添加劑能夠應(yīng)用在培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞方面，包括人在 內(nèi)的所有哺乳動(dòng)物的神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞的培養(yǎng)，使用范圍極為廣泛。
[0039] 2、本發(fā)明添加劑對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，在添加N2的基礎(chǔ)上，該培養(yǎng)添加劑具有最 強(qiáng)的促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用，細(xì)胞增殖比只有N2時(shí)高出30%，其效果優(yōu)于復(fù)雜且昂貴的 B27(圖1)。相比之下B27比只有N2時(shí)只高出微不足道的5%，而且沒(méi)有顯著性差異；在N2 和該培養(yǎng)添加劑基礎(chǔ)上增加三碘-L-甲狀腺原氨酸（T3)或維生素E對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)有 抑制作用，而其他的B27成分包括皮質(zhì)酮，視黃醇，脂酸，谷胱甘肽，過(guò)氧化氫酶+超氧化物 歧化酶（SOD)則無(wú)明顯的添加作用。這些結(jié)果證明N2加上簡(jiǎn)化培養(yǎng)添加劑足以滿足神經(jīng) 干細(xì)胞高度生長(zhǎng)的需要，沒(méi)有必要添加其它的B27培養(yǎng)添加劑的成分，因此節(jié)約了成本。
[0040] 3、本發(fā)明添加劑對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，在N2的