Talaromyces thermo-citrinum 生產(chǎn)耐熱超氧化物歧化酶(SOD)的方法
【專利說明】Talaromyces thermo-c i tr i num生產(chǎn)耐熱超氧化物歧化酶
(SOD)的方法
技術領域
[0001]利用Talaromyces thermo-citrinum生產(chǎn)超氧化物歧化酶(SOD)，屬于生物工程技術領域。本發(fā)明涉及利用菌株Talaromyces thermo-citrinum保藏號為ATCC36868，通過液態(tài)發(fā)酵獲得耐高溫S0D。
【背景技術】
[0002]超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡稱SOD)具有良好的防御氧毒性的作用，能夠增強機體抗輻射損傷的能力。近年來，它已經(jīng)成為治療炎癥、腫瘤和自身免疫疾病的新型抗炎藥物；化妝品和食品行業(yè)中用于防曬、防皮膚衰老和抗炎的添加劑以及用于某些疾病探針的生化試劑。SOD廣泛存在于動物、植物、所有好氧微生物及少數(shù)厭氧微生物體內(nèi)。當前，SOD主要從動物血液(如豬血或者牛血)中提取(袁燁.超氧化物歧化酶的制備方法[P].申請?zhí)枺?2147888.0, 2002-12-19 ;徐文中，閻家麒.超氧化物歧化酶大規(guī)模生產(chǎn)新工藝[P].申請?zhí)枺?1144922.5，2001-12-24)，產(chǎn)量受到很大限制，且容易受到原料來源、安全性及質(zhì)量不穩(wěn)定等因素的影響。由于動物、植物特別是動物血液來源困難，而微生物可以人工培養(yǎng)，有利于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。根據(jù)目前報道，已經(jīng)可以通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)S0D，但主要為胞內(nèi)酶(刁治民，姚銀霞，張文靜.酵母菌SOD發(fā)酵條件的研宄[J].青海師范大學學報(自然科學版)，2002，4:48-51 ;楊明琰，郭愛蓮，沈儉，等.高產(chǎn)SOD酵母菌的誘變選育及發(fā)酵條件研宄[J].食品科學，2005，26(10): 147-150)，提取工藝較為繁瑣。
[0003]天然SOD熱穩(wěn)定性較差，在加工和使用過程中容易受熱失活。如何有效地解決SOD在高溫工藝條件下酶活力的穩(wěn)定問題，如何使含SOD的產(chǎn)品在生產(chǎn)工藝流程中不用顧忌高溫是高效利用SOD的關鍵。利用生物工程生產(chǎn)新一代高穩(wěn)定性、高耐熱性的SOD是當前SOD開發(fā)最重要的途徑。
[0004]本發(fā)明米用Talaromyces thermo-citrinum 生產(chǎn) S0D， Talaromycesthermo-citrinum是一種耐熱菌，可以產(chǎn)生耐高溫的S0D,采用該菌發(fā)酵生產(chǎn)SOD具有發(fā)酵周期短，發(fā)酵液中SOD活力較高，且能耐高溫，開發(fā)前景廣闊。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]目前能夠產(chǎn)生SOD的菌株比較少，主要為一些酵母，且為胞內(nèi)酶，需要破壁后才能提取分離，操作成本高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)制備。本發(fā)明的目的是針對當前問題，利用菌株Talaromyces thermo-citrinum保藏號為ATCC 36868，通過液態(tài)發(fā)酵獲得胞外耐熱S0D。
[0006]本發(fā)明的技術方案如下:液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成是碳源0.5_100g/l，氮源0.5-100g/l，K2HP04l-4g/l，MgS047H20 0.1-0.5g/l，NaCl l_2g/l。在一定體積的發(fā)酵罐內(nèi)裝入發(fā)酵體積60-70% (v/v)的培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接入Talaromyces thermo-citrinum,接種量為1-10 %，起始PH和發(fā)酵過程pH均為自然，發(fā)酵溫度為20-60°C，發(fā)酵周期為2_6天。最終發(fā)酵液中SOD活力最高可達1500U/ml。
[0007]本發(fā)明所有種子培養(yǎng)基配方與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。將斜面菌種接種到裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶后，種子的培養(yǎng)時間為48小時，種子的培養(yǎng)溫度為45°C。
[0008]菌種保存用斜面培養(yǎng)基配方為:葡萄糖20g/l，MgS047H20 0.2g/l，酵母膏g/1，瓊脂20g/l，pH自然。
[0009]SOD活的測定方法是基于SOD抑制氮藍四唑(NBT)在光下的還原作用。SOD活力測定方法和 SOD 活力定義詳見:Chin_Wen Lin, Jeng-Huh Yang and Lieh-Chi Su, Theextract1n and properties of superoxide dismutase from porcine blood Chin-ffenLin, Jeng-Huh Yang and Lieh-Chi Su，Meat Science，1997，46(3):303-312.
[0010]本發(fā)明有如下特征:
[0011](I)Talaromyces thermo-citrinum用于SOD發(fā)酵的碳源可以是葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、鹿糖、乳糖、半乳糖。氮源可以是(NH4)2SCV NH4Cl、NH4N03、NaN03、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、玉米漿、黃豆餅粉。
[0012](2) Talaromyces thermo-citrinum 發(fā)酵 SOD 采用的發(fā)酵罐體積為 5-50L。攪拌轉(zhuǎn)速為70-150r/min，通風量1:0.1-1:0.5v/v/m。結(jié)合本領域的基本常識可根據(jù)生產(chǎn)情況調(diào)整發(fā)酵罐大小。
[0013]本發(fā)明的有益效果:首次采用Talaromyces thermo-citrinum進行了 SOD的發(fā)酵，不僅酶活高，而且生產(chǎn)的SOD具有良好的耐熱效果，該方法適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)耐熱S0D，不僅解決當前SOD不耐熱的缺點，而且提供了大量的SOD來源。
【具體實施方式】
[0014]實施例1
[0015]將斜面菌種接種到裝有50ml培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，培養(yǎng)基組成為:葡萄糖20g/l，牛肉膏 10g/l，蛋白胨 10g/l，NH4NO31g/!，玉米漿粉 12g/l，pH 自然。45°C，發(fā)酵 72小時。發(fā)酵結(jié)束后，將50ml發(fā)酵液10000轉(zhuǎn)/min離心，去除菌體。上清粗酶液用于測定酶的PH及溫度參數(shù)。取上清粗酶液0.5ml，分別置于pH 4，5，6，7，8的檸檬酸一磷酸緩沖液3.5ml 中，在 55°C下測定 SOD 活力分別為 1200，1500，1200，1100，1000U/ml。因此該 SOD 的最適反應pH是5。分別取上清粗酶液0.5ml，與3.5ml pH 5的檸檬酸一磷酸鹽緩沖液混合，在 25，35，45，55，65°C 下分別測得酶活為 1000，1200，1300，1500，1300U/ml，因此該酶的最適溫度為55°C。分別取上清粗酶液0.5ml，與3.5ml pH 5的檸檬酸一磷酸鹽緩沖液混合，在25，35，45，55，65，75°C下保溫48小時，然后測定酶活分別為1500，1500，1500，1500，1500，1400U/ml，結(jié)果表明該酶具有良好的耐熱性。不同pH的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液的配制方法參見:諸葛健，工業(yè)微生物實驗技術手冊，中國輕工業(yè)出版社，1994。
[0016]實施例2
[0017]將斜面菌種接種到裝有50ml的種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，種子培養(yǎng)基組成為:葡萄糖20g/l，牛肉膏10g/l，蛋白胨10g/l，NH4NO31g/!，玉米漿粉12g/l，pH自然，121滅菌20min，搖床轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘，45°C下培養(yǎng)48小時。該過程有10個相同的三角瓶，共得到500ml種子液。
[0018]將500ml種子液接種入50L發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖20g/l，牛肉膏10g/l，蛋白胨3g/l，NH4NO31g/!，玉米漿粉6g/l，pH自然，發(fā)酵溫度為45°C，裝液量70%，通風量為1:1.5v/v/mo發(fā)酵時間為3天。在該條件下，發(fā)酵液中最終SOD活力為1300U/ml。
[0019]實施例3
[0020]將培養(yǎng)好的IL種子液接種到1L發(fā)酵罐中。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基組成均為:果糖30g/l，牛肉膏 10g/l，玉米漿粉 20g/l，K2HP044g/l，MgS047H20.5g/l，pH 自然。發(fā)酵溫度為20°C，裝液量70%，通風量為1:0.3v/v/m,發(fā)酵時間為5天，在該條件下，發(fā)酵液中最終SOD活力為l500U/ml。
[0021]實施例4
[0022]將培養(yǎng)好的2L種子液接種到20L發(fā)酵罐中。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:乳糖20g/l，NH4NO31g/!，蛋白胨10g/l，pH自然。接種量為10 %，培養(yǎng)溫度為60°C，裝液量60 %，通風量為1:0.5v/v/m，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min，發(fā)酵時間為6天，在該條件下，發(fā)酵液中最終SOD 活力為 1400U/mlo
[0023]實施例5
[0024]將培養(yǎng)好的300ml種子液接種到5L發(fā)酵罐中。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基組成均為:蔗糖20g/l，NH4NO31g/!，蛋白胨10g/l，pH自然。發(fā)酵溫度為40°C，裝液量65 %，通風量為1:0.lv/v/m，攪拌轉(zhuǎn)速為70r/min，發(fā)酵周期為3天。在該條件下，發(fā)酵液中最終SOD活力為1200U/mlo
[0025]實施例6
[0026]將培養(yǎng)好的3.5L種子液接種到50L發(fā)酵罐中。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基組成均為:麥芽糖15g/l，酵母膏5g/l，蛋白胨10g/l，黃豆餅粉5g/l，pH自然，發(fā)酵溫度為28°C，裝液量70%，通風量為1:0.4v/v/m，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min，發(fā)酵周期為5天。在該條件下，發(fā)酵液中最終SOD活力為1100U/ml。
[0027]實施例7
[0028]將培養(yǎng)好的600ml種子液接種到1L發(fā)酵罐中。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基組成均為:半乳糖15g/l，酵母膏5g/l，蛋白胨5g/l，尿素5g/l，pH自然。發(fā)酵溫度為30°C，裝液量60%，通風量為1:0.3v/v/m，攪拌轉(zhuǎn)速為120r/min，發(fā)酵時間為4天。在該條件下，發(fā)酵液中最終SOD 活力為 1350U/mlo
[0029]實施例8
[0030]將培養(yǎng)好的250ml種子液接種到5L發(fā)酵罐中。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基組成均為:木糖10g/l，酵母膏 5g/l，NaCl lg/l，K2HP04lg/l，MgSOJH2O 0.lg/l，pH 自然。發(fā)酵溫度為 45°C，裝液量50%，通風量為1: 1.2v/v/m,發(fā)酵時間為2天。在該條件下，發(fā)酵液中最終SOD活力為 1450U/mlo
【主權項】
1.本發(fā)明利用Talaromycesthermo-citrinum通過液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)耐熱的超氧化物歧化酶(SOD) ο
2.根據(jù)權利要求1所述的Talaromycesthermo-citrinum，其特征在于可利用的產(chǎn)SOD的碳源為葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、乳清。
3.根據(jù)權利要求1所述的Talaromycesthermo-citrinum，其特征在于可利用的產(chǎn)SOD的氮源為無機銨鹽、無機硝酸鹽、蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米漿、豆餅粉。
【專利摘要】利用Talaromyces thermo-citrinum生產(chǎn)超氧化物歧化酶(SOD)，屬于生物工程技術領域。本發(fā)明采用Talaromyces thermo-citrinum在液態(tài)發(fā)酵條件下生產(chǎn)SOD，為胞外酶。耐熱SOD產(chǎn)量最高可達1500U/ml，本發(fā)明具有良好的工業(yè)應用前景。
【IPC分類】C12N9-02, C12R1-645
【公開號】CN104694505
【申請?zhí)枴緾N201510070759
【發(fā)明人】丁彥蕊, 饒榕, 牟兆琳, 王雪芹
【申請人】江南大學
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年2月10日