一種精氨酸脫亞胺酶的胞外表達(dá)方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種精氨酸脫亞胺酶的胞外表達(dá)方法及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] ADI具有水解活性，可將L-精氨酸鹽水解生成L-瓜氨酸。L-瓜氨酸在醫(yī)藥用品、 保健食品以及化妝品中應(yīng)用前景廣闊。利用ADI生產(chǎn)瓜氨酸由于原料易得、工藝簡單、產(chǎn)物 濃度高、純化步驟少等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為瓜氨酸生產(chǎn)的潛力途徑。
[0003]ADI是一種僅發(fā)現(xiàn)于微生物中的精氨酸降解酶，已有多種不同微生物來源的ADI 基因被克隆，并表達(dá)。1989年，Burne等人將鏈球菌（Streptococcussanguis)ADI途徑基 因在E.coli中表達(dá)。1994年，Takaku等人將支原體（Mycoplasmaarginini)ADI基因于大 腸桿菌克隆表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物形成包涵體，采用6mol/L鹽酸胍變性，復(fù)性后比酶活33. 6U/mg。 2002年，Oudjama等人從銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa)中克隆了ADI基因，然 后在E.coli中表達(dá)。同年，肯塔基州大學(xué)FrederickW等人將MycoplasmahominisADI 基因于大腸桿菌中表達(dá)，得到的重組ADI以包涵體形式存在，將包涵體復(fù)性后，得到重組酶 比酶活為19-21IU/mg蛋白質(zhì)。
[0004] 2006年，孟繁君等人利用假單胞菌（Pseudomonassp.)發(fā)酵制備ADI，以葡萄糖 為碳源，酵母膏和蛋白胨為氮源，30°C振蕩培養(yǎng)20h時，發(fā)酵液中精氨酸脫亞胺酶的酶活 力可達(dá)2. 17U/ml。2011年，劉媛媛等人對惡臭假單胞菌UN0705產(chǎn)ADI的發(fā)酵條件進(jìn)行 了研宄：在培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)基初始pH值為6. 6,接種量4 %，裝液量40mL/250mL，發(fā)酵 時間50h時，精氨酸脫亞胺酶酶活最大值為9. 32U/mL。同年，劉詠梅等人對變形假單胞菌 CGMCC2039ADI誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，宿主菌在A_達(dá)到1. 0時加入0. 2mMIPTG，在30°C 誘導(dǎo)4h酶活最高，為2. 04U/mL發(fā)酵液。
[0005] 基因工程表達(dá)外源蛋白一般分為胞內(nèi)表達(dá)和胞外表達(dá)兩種類型。上述ADI基因在 大腸桿菌中的克隆表達(dá)均為胞內(nèi)表達(dá)，需進(jìn)行超聲波破碎得到ADI粗酶液，工藝較為繁瑣； 胞外表達(dá)可簡化下游純化工藝，節(jié)約成本，因此在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中具有絕對優(yōu)勢。
[0006] 外源基因在大腸桿菌中克隆表達(dá)，胞內(nèi)表達(dá)型蛋白需要透過細(xì)胞膜實(shí)現(xiàn)外源分 泌。大腸桿菌的細(xì)胞膜主要成分為磷脂、飽和脂肪酸及磷脂酞乙醇胺等，在培養(yǎng)基中添加諸 如青霉素、表面活性劑、甘露醇等化學(xué)試劑，可在一定程度上破壞細(xì)胞膜的完整性，從而增 加其通透性，加快胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌速率，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白在培養(yǎng)基中的積累，提高發(fā)酵產(chǎn)量。
[0007] 角質(zhì)酶是一種多功能酶，可水解各種可溶性酯類及不溶性脂肪酸酯等，因此可代 替化學(xué)試劑，水解大腸桿菌細(xì)胞膜的磷脂成分，增加細(xì)胞膜的通透性，保證細(xì)胞完整性的情 況下使胞內(nèi)蛋白分泌到胞外。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了一種將精氨酸脫亞胺酶進(jìn)行胞外表達(dá)的方法及其應(yīng)用，是將共表達(dá) 角質(zhì)酶和精氨酸脫亞胺酶的重組大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，將ADI進(jìn)行胞外表達(dá)，并通過優(yōu) 化發(fā)酵條件提高ADI的表達(dá)量。得到的ADI用于制備L-瓜氨酸。
[0009] 所述精氨酸脫亞胺酶的胞外表達(dá)方法，是構(gòu)建能夠共表達(dá)核苷酸序列如SEQID NO. 1所示的角質(zhì)酶與氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示的精氨酸脫亞胺酶的重組大腸桿 菌，在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)后收集發(fā)酵上清液；所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件是：發(fā)酵 罐裝液量為40-70%，重組大腸桿菌種子液接種量為8-10%，在35-38°C培養(yǎng)，并控制溶氧 25-35 %、控制pH6. 8-7. 2，當(dāng) 0D6QQ達(dá)到 40-60 時，將溫度調(diào)至 28-32 °C，pH調(diào)至 6. 3-6. 7，以 終濃度0. 05-0.lg?I71 ? 1T1恒速流加乳糖，并添加終濃度為0. 02-0. 05mMIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。
[0010] 所述角質(zhì)酶來源于Thermobifidafusca，所述精氨酸脫亞胺酶來源于惡臭假單胞 菌（PseudomonasputidaACCC10185)〇
[0011] 所述角質(zhì)酶的核苷酸序列，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是SEQIDNO. 1所示的經(jīng) 過優(yōu)化的角質(zhì)酶基因序列。優(yōu)化后的角質(zhì)酶基因與精氨酸脫亞胺酶進(jìn)行共表達(dá)，能夠顯著 提高精氨酸脫亞胺酶的胞外表達(dá)量。這一核苷酸序列編碼NCBI編號為AAZ54921 (含有信 號肽）的角質(zhì)酶的成熟蛋白。
[0012] 所述發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，每L含有：蛋白胨 0? 9-1.lg，酵母粉 1. 9-2.lg，（NH4) 2HP043. 9-4.lg，KH2P0413-14g，檸檬酸 1. 5-2g，無水硫酸鎂 0? 6-0. 7g，甘油 7. 5-8. 5g，微量元素液 9. 5-10. 5ml，pH6. 8-7. 0
[0013] 所述蛋白胨和酵母粉，是產(chǎn)品純度為工業(yè)級或者分子試劑級別均可。
[0014] 所述微量元素液的配方，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為：以5M HC1為母液， FeS04 ? 7H209. 5-10. 5g ?廠1，ZnS04 ? 7H20 2. 0-2. 5g ?廠1，CuS04 ? 5H20 0? 9-1. lg ?廠\ MnS04 ? 4H20 0? 45-0. 55g ? I71，Na2B407 ? 10H20 0? 2-0. 25g ? I71，CaCl2l. 9-2. lg ? I71，（NH4) 6M〇70240. 09-0. llg ? L
[0015] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，1. 2L中具體含有：工業(yè)級蛋 白胨1. 2g，工業(yè)級酵母粉2. 4g，（NH4)2HP044. 8g，KH2P0416 . 24g，檸檬酸2. 04g，無水硫酸鎂 0? 824g，甘油 9. 6g，微量元素液 12ml，pH7. 0。
[0016] 所述誘導(dǎo)，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，誘導(dǎo)時間為45_55h。
[0017] 所述重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是將編碼精氨酸 脫亞胺酶的基因和編碼角質(zhì)酶的基因克隆到pETDuet-1上得到重組質(zhì)粒Tfu_0883/ADI/ pETDuet-1，然后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌宿主，即得到重組大腸桿菌。
[0018] 所述宿主，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為E.coliBL21(DE3)。
[0019] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種按上述方法得到的精氨酸脫亞胺酶。
[0020] 本發(fā)明的第三個目的是提供所述精氨酸脫亞胺酶在制備L-瓜氨酸方面的應(yīng)用。
[0021] 所述應(yīng)用，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是在底物濃度為100_106g/L的L-精氨酸 鹽酸鹽或L-精氨酸中，按每g底物添加22-25U的精氨酸脫亞胺酶，在初始pH5. 9-6. 1，溫 度35-38°C，轉(zhuǎn)速100_200r/min下進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
[0022] 本發(fā)明的有益效果：
[0023] (1)實(shí)現(xiàn)了精氨酸脫亞胺酶的胞外表達(dá)，可簡化下游純化工藝，節(jié)約成本，在大規(guī) 模工業(yè)化生產(chǎn)中具有絕對優(yōu)勢。
[0024] (2)采用優(yōu)化后的角質(zhì)酶基因，與精氨酸脫亞胺酶進(jìn)行共表達(dá)，顯著提高了精氨酸 脫亞胺酶的胞外表達(dá)量。由于共表達(dá)載體的啟動子是一樣的，共表達(dá)的時候兩個基因的表 達(dá)是競爭性的，角質(zhì)酶處于弱勢，表達(dá)量低，會影響ADI的胞外分泌。角質(zhì)酶基因進(jìn)行優(yōu)化 后，角質(zhì)酶表達(dá)量提高，與ADI的表達(dá)達(dá)到平衡，能顯著提高ADI的產(chǎn)量。而且，可以降低使 用的誘導(dǎo)劑量，有利于菌株生長。
[0025] (3)結(jié)合發(fā)酵條件控制，使精氨酸脫亞胺酶的胞外表達(dá)量達(dá)到了 100U/mL，為現(xiàn)有 報(bào)道的最高產(chǎn)量。
[0026] (4)本發(fā)明方法得到的ADI的酶學(xué)性質(zhì)與單獨(dú)表達(dá)ADI酶學(xué)性質(zhì)一致，用于制備 L-瓜氨酸，其轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%。
【附圖說明】
[0027] 圖1為3L罐發(fā)酵不同誘導(dǎo)溫度的ADI胞外酶活；
[0028] 圖2為重組菌3L罐中發(fā)酵上清的SDS-PAGE分析，其中18h、24h、30h、36h、42h、 4811、5處、5711、6611為重組菌在31罐不同誘導(dǎo)時間的發(fā)酵上清液，11為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；
[0029] 圖3為3L罐發(fā)酵不同乳糖誘導(dǎo)濃度的ADI胞外酶活；
[0030] 圖4為利用ADI制備L-瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率隨時間的變化。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 實(shí)施例1重組菌株的構(gòu)建
[0032] 將編碼精氨酸脫亞胺酶的ADI基因連接到pET_24a(+)載體上得到 pET-24a(+)-ADI，以pET-24a(+)-ADI為模板，利用定點(diǎn)突變，將第978C突變成G，防止 XhoI將ADI基因切斷。同時，將編碼角質(zhì)酶的基因克隆到pETDuet-1上得到Tfu_0883/ pETDuet-1。突變后的ADI/pET-24a(+)質(zhì)粒與Tfu_0883/pETDuet-l質(zhì)粒經(jīng)NdeI和XhoI 雙酶切，割膠回收Tfu_0883/pETDuet-l載體與ADI基因，再用T4連接酶16°C連接過夜，連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB固體平 板，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子于含100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，試劑 盒抽提得到重組質(zhì)粒Tfu_0883/ADI/pETDuet-l〇
[0033]將Tfu_0883/ADI/pETDuet-l轉(zhuǎn)化E.coliBL21 (DE3)宿主菌，在含 100mg/L氨芐 青霉素的LB固體平板上經(jīng)37°C培養(yǎng)8-10h，挑選轉(zhuǎn)化子，測序正確的即為重組菌株。
[0034] 實(shí)施例2角質(zhì)酶基因?qū)χ亟M菌株表達(dá)ADI的影響
[0035] 以SEQIDNO. 1所示的序列為角質(zhì)酶基因序列，按照實(shí)施例1的方法構(gòu)建得到重 組大腸桿菌A。以氨基酸序列相同的、序列如SEQIDNO. 3所示的角質(zhì)酶基因，按照實(shí)施例 1的方法構(gòu)建的共表達(dá)角質(zhì)酶和精氨酸脫亞胺酶的重組大腸桿菌B作為對照，比較ADI的胞 外表達(dá)效果。
[0036] 分別將重組菌A、B進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)方法為：
[0037] 重組菌在LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)8-10h，以5%接種量轉(zhuǎn)接TB發(fā)酵培養(yǎng)基（蛋