哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的制作方法
【專利說明】哺乳動(dòng)物表達(dá)載體
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年12月18日、發(fā)明名稱為"哺乳動(dòng)物表達(dá)載體"的中國(guó) 專利申請(qǐng)200980151764. 8(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP2009/067540)的分案申請(qǐng)。
[0002] 本發(fā)明描述用于整合進(jìn)哺乳動(dòng)物基因組的新的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體（含有或不含 有目的基因，GOI)，所述載體包含新的調(diào)控元件組合。特別地，本發(fā)明描述了包含以下調(diào)控 元件的表達(dá)載體：猿猴病毒40增強(qiáng)子和早期啟動(dòng)子區(qū)和Hbb內(nèi)含子II，或其片段、衍生物 和修飾物，其中所述表達(dá)載體能夠接納至少一個(gè)目的基因并使其表達(dá)。優(yōu)選地，這樣的表達(dá) 載體包含至少一個(gè)選擇標(biāo)記基因（例如，包括目的基因的PDGP，見圖1 ;例如，不含目的基因 的pDGP A GOI)。載體（不含目的基因）允許至少一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)或更多目的基因的摻入，其 之后的表達(dá)和使用例如遺傳霉素（G418)和/或甲氨蝶呤（MTX)選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。作為根 據(jù)本發(fā)明的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的實(shí)例的pDGP A GOI載體顯示了 9555bp的序列，其一條鏈由 SEQ ID NO:2代表。作為根據(jù)本發(fā)明的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的另一個(gè)示例，pDGP-AAGOI載體 顯示了 383(^口的序列，其一條鏈由3￡〇10勵(lì):3代表。
[0003]目前必須在大量細(xì)胞庫中進(jìn)行多次連續(xù)選擇步驟以在細(xì)胞克隆以前生成和篩選 高產(chǎn)細(xì)胞庫。因此培育細(xì)胞系是費(fèi)時(shí)和費(fèi)力的活動(dòng)。
[0004] 有大量出版物論述了調(diào)控元件對(duì)表達(dá)水平的影響。
[0005] 早就知道位于G0I編碼序列中或緊接在G0I編碼序列之前的不同內(nèi)含子序列的正 面作用并在許多出版物（2, 4, 5, 6)中描述。進(jìn)行了致力于不同啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率的研宄并 將CMV啟動(dòng)子鑒定為最有效的（2, 3, 4, 5, 6)。因此，目前在大多數(shù)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中的 G0I表達(dá)盒是由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的并在G0I編碼序列緊接的上游具有內(nèi)含子序列。
[0006] 就特定表達(dá)載體中的G0I表達(dá)盒和選擇標(biāo)記基因的組合而言，已報(bào)導(dǎo)并在功能上 檢驗(yàn)了幾種組合（1)。對(duì)單克隆抗體（mAb)表達(dá)，描述了使用單獨(dú)表達(dá)輕鏈和重鏈的2種載 體以及含有2種mAb鏈的表達(dá)盒和在同一質(zhì)粒上具有neo和dhfr表達(dá)盒的載體的解決方 案⑴。
[0007] 在大多數(shù)情況下僅使用細(xì)胞內(nèi)報(bào)告蛋白例如熒光素酶（2, 5, 6)測(cè)定瞬時(shí)表達(dá)水 平。通過此方法很難預(yù)測(cè)調(diào)控元件和/或載體在整合進(jìn)染色體后將如何影響分泌蛋白質(zhì)的 穩(wěn)定表達(dá)水平，其中最終表達(dá)水平是轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和分泌速度的復(fù)雜相互作用結(jié) 果。盡管此問題對(duì)生物制藥工業(yè)是最重要的，其在文獻(xiàn)中很少涉及（3)。特別地，似乎從未 討論過調(diào)控元件和選擇標(biāo)記的特定組合與開發(fā)細(xì)胞系所需的時(shí)間和細(xì)胞系的開發(fā)效率的 相關(guān)性。因此，本發(fā)明的主要目的是尋找在上述參數(shù)時(shí)間和效率方面比本領(lǐng)域已知的調(diào)控 元件和選擇標(biāo)記組合更好的組合。
[0008] 由此，本發(fā)明克服了上述不足并提供了用于整合進(jìn)各個(gè)哺乳動(dòng)物基因組中的哺乳 動(dòng)物表達(dá)載體（特別是分別顯示SEQ ID N0:2的序列的名為pDGPAGOI的和顯示SEQ ID NO: 3的序列的名為pDGP-A A GOI的載體（如果缺乏目的基因）；和名為pDGP和pDGP-A的載 體（如果包括目的基因），見圖1和3)，其包含下列調(diào)控元件的新組合：猿猴病毒40 (SV40) 增強(qiáng)子和早期啟動(dòng)子區(qū)，Hbb內(nèi)含子II，或該內(nèi)含子的片段、衍生物和修飾物（其與文獻(xiàn)例 如Xu等人（2)中描述的嵌合內(nèi)含子不同，因此絕對(duì)不能與其混淆），和任選地至少一種選擇 標(biāo)記基因（例如neo, dhfr)。這些表達(dá)載體適于接納至少一個(gè)目的基因，并且如果接納了目 的基因，能使其表達(dá)并之后能使用至少一種合適的選擇試劑（例如G418和/或MTX)選擇 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。即使用G418的一步選擇可選擇以高量和以高度可重現(xiàn)方式表達(dá)由至少一種 目的基因編碼的至少一種多肽的細(xì)胞，由此顯著減少開發(fā)細(xì)胞系的時(shí)間和工作量。
[0009] 作為邊注，應(yīng)當(dāng)考慮以下因素：在現(xiàn)有技術(shù)中已知的在兩個(gè)或更多選擇步驟（其 中之一通常為MTX選擇）后整合進(jìn)基因組的表達(dá)載體通常產(chǎn)生含有幾個(gè)整合進(jìn)其基因組的 G0I拷貝的細(xì)胞，因此以增加的速度表達(dá)G0I。完全相反地，本發(fā)明的表達(dá)載體不需要將其 多個(gè)拷貝整合進(jìn)基因組和/或兩輪或更多輪選擇步驟以使哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞以增加的速 度表達(dá)G0I。這是根據(jù)本發(fā)明的調(diào)控元件組合的直接結(jié)果并在于增加的表達(dá)速度而與整合 進(jìn)基因組的基因拷貝數(shù)無關(guān)。因此本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)是無需進(jìn)行分別使用G418和MTX的至少 一步選擇步驟以獲得令人滿意的表達(dá)速度，但使用G418或MTX的僅一步選擇（例如示例性 選擇系統(tǒng)）就足夠。
[0010] 如本文使用的術(shù)語"Hbb內(nèi)含子II"涉及顯示人0-珠蛋白（hbb)基因的第二個(gè) 內(nèi)含子（Hbb內(nèi)含子2)序列的任意核酸分子，其包括在所述hbb基因的Hbb內(nèi)含子2上游 緊接的l〇bp序列和在hbb基因的Hbb內(nèi)含子2下游緊接的10bp序列。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語 "Hbb內(nèi)含子II的片段、衍生物和修飾物"包括能夠在嚴(yán)格雜交條件下與Hbb內(nèi)含子II雜 交并（當(dāng)與SV40增強(qiáng)子和早期啟動(dòng)子區(qū)組合時(shí)）具有與SV 40增強(qiáng)子/啟動(dòng)子組合中的 Hbb內(nèi)含子II相同的表達(dá)增強(qiáng)活性的核酸分子。特別地，術(shù)語"Hbb內(nèi)含子II的片段、衍生 物和修飾物"包括與顯示SEQ ID NO: 1序列的核酸分子鏈，或與互補(bǔ)物，或其片段在嚴(yán)格雜 交條件下雜交的核酸分子，并且在相同的SV40增強(qiáng)子/啟動(dòng)子組合中其具有與顯示SEQ ID NO: 1序列的核酸分子相同的表達(dá)增強(qiáng)活性。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，Hbb內(nèi)含子II顯 示SEQ ID N0:1所示的序列。
[0011] 如何進(jìn)行核酸分子的雜交實(shí)驗(yàn)是本領(lǐng)域熟知的，即本領(lǐng)域技術(shù)人員知道依照本發(fā) 明她/他必須使用什么雜交條件。這些雜交條件在標(biāo)準(zhǔn)教科書例如Molecular Cloning A Laboratory Manual(Sambrook J., Russell D. ff. )Cold Spring Harbor Laboratory(2001) N. Y. , Current Protocols in Molecular Biology (編：Ausubel F. M. , Brent R. , Kingston R. E. , Moore D. D. , Seidman J. G, Smith J. A. , Struhl K.) [Core publication in 1987 -quarterly updated]Copyright? 2007by John Wiley and Sons, Inc?中提及。
[0012] "嚴(yán)格雜交條件"指例如在包含50%甲酰胺，5x SSC(750mM NaCl，75mM檸檬酸 鈉），50mM磷酸鈉（pH 7. 6)，5x Denhardt' s溶液，10%硫酸葡聚糖和20mg/ml變性的已剪 切的鮭精DNA的溶液中于40 - 60°C孵育過夜，接著在0. lx SSC中于約65°C洗滌濾器。也 考慮在較低的嚴(yán)格度雜交條件下與顯示SEQ ID N0:1的序列的核酸分子，或其互補(bǔ)物，或其 部分雜交的核酸分子。雜交嚴(yán)格度和信號(hào)檢測(cè)的變化主要通過操縱甲酰胺濃度（較低百分 比的甲酰胺導(dǎo)致較低的嚴(yán)格度）；鹽濃度或溫度實(shí)現(xiàn)。例如，較低的嚴(yán)格度條件包括在包含 6X SSPE(20X SSPE = 3M NaCl;0.2M NaH2P04;0.02M EDTA，pH 7.4)，0.5%SDS，30% 甲酰 胺，lOOmg/ml變性的已剪切的鮭精DNA的溶液中于37°C過夜孵育；接著在IX SSPE，0. 1% SDS中洗滌。此外，為了獲得甚至更低的嚴(yán)格度，在嚴(yán)格雜交后進(jìn)行的洗滌可在較高鹽濃度 (例如5X SSC)下進(jìn)行。值得一提的是可通過包括和/或替換用于在雜交實(shí)驗(yàn)中抑制背景 的替代封閉試劑實(shí)現(xiàn)上述條件中的變化。一般的封閉試劑包括Denhardt' s試劑，BL0TT0， 肝素，變性的鮭精DNA和市售的專賣制劑。由于相容性的問題，加入特定封閉試劑可能需要 上述雜交條件的修飾。
[0013] 因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面包括提供用于整合進(jìn)哺乳動(dòng)物基因組的表達(dá)載體，所 述表達(dá)載體包含以下調(diào)控元件：猿猴病毒40(SV40)增強(qiáng)子和早期啟動(dòng)子區(qū)和Hbb內(nèi)含子 II，或其片段、衍生物和修飾物，優(yōu)選地所述內(nèi)含子顯示SEQ ID NO:l的序列，其中所述表達(dá) 載體能夠接納至少一個(gè)目的基因并使其表達(dá)。
[0014] 本發(fā)明的該方面的優(yōu)選實(shí)施方案為
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